罹病香蕉假莖象甲蘇格蘭白僵菌的分離鑒定及其生物學特性

摘要 對云南省西雙版納州和昆明市東川區罹病的香蕉假莖象甲Odoiporus longicollis進行了病原分離。通過形態學鑒定及rDNA-ITS序列比對，確定分離到的4個菌株均為蘇格蘭白僵菌Beauveria caledonica。通過對這4個分離株的離體培養條件探索及毒力測定，表明離體培養的最佳條件為光周期L∥D=24 h//0h、溫度25℃、在加有蟲粉的PDA培養基上培養18d，此條件下的4個菌株菌落直徑和產孢量最高，其中Cs-1達到（65.17±0.74） mm和1.01×10⁸個／cm²，乳糖和牛肉膏分別為最適碳、氮源。生物測定結果表明，Cs-1菌株在接種濃度為1×10⁹個／mL時對香蕉假莖象甲致死中時（LT₅₀）最短，為9.254d，致死中濃度（LCso）為3.618×106個／mL，20 d后的致死率為86.67%。本研究首次在云南蕉園發現并鑒定的4株昆蟲病原真菌均為蘇格蘭白僵菌，Cs-1菌株對香蕉假莖象甲具有較好的生防潛力，可望今后應用于香蕉假莖象甲的生物防治。

關鍵詞 香蕉假莖象甲；蘇格蘭白僵菌；生物學特性；致病力

中圖分類號：S 476.12 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2024235

香蕉Musa spp.是世界上重要的熱帶亞熱帶水果，在許多發展中國家已成為繼水稻、小麥、玉米后的第四大糧食作物，年貿易量位居各類水果之首。我國是世界香蕉消費第一大國，香蕉生產第二大國，2021年種植面積達32.59萬hm²，是帶動鄉村振興的重要支柱產業。然而在香蕉產業發展的同時，病蟲害對香蕉生產的威脅也日趨嚴重，其中香蕉假莖象甲Odoiporus longicollis就是危害最為嚴重的害蟲之一。香蕉假莖象甲屬鞘翅目Coleoptera隱頦象甲科Dryophthoridae，其在幼蟲和成蟲階段取食香蕉植株假莖，使植株養分運輸受阻，嚴重時甚至導致香蕉植株倒伏，是香蕉產量降低、品質下降的重要影響因素。其在海南、廣東、廣西、云南等香蕉主產區的為害呈現加重趨勢，特別是近年來在云南等地區由于每年11月至翌年4月干旱少雨，導致香蕉假莖象甲為害更加嚴重。因此，如何有效防治香蕉假莖象甲已成為香蕉產業發展面臨的一個重要問題。

目前，香蕉假莖象甲的防治措施主要以化學防治為主，但由于香蕉假莖象甲的活動區域主要為香蕉假莖內部，假莖的包裹很大程度限制了蟲體和農藥的接觸機會；其次，不合理的農藥施用時有發生，嚴重影響甚至破壞生態平衡，是環境污染的重要原因之一。隨著人們對生活品質和綠色觀念的提升，采用綠色防控措施迫在眉睫。

生物防治是現代農業防治措施的重要抓手，“以菌治蟲”是農業害蟲生物防治的重要措施之一，是推動農藥減量控害的關鍵手段。其中，昆蟲病原真菌（entomopathogenic fungi，EPF）因其以昆蟲為寄主，能在昆蟲群落內大范圍傳播，引起寄主昆蟲致病甚至死亡而備受關注。EPF易于在蟲體間傳播，同時不易使昆蟲產生抗性、對環境兼容性好，作為生物殺蟲劑，已普遍用于害蟲防治。在眾多EPF中，白僵菌Beau Poeria能夠寄生700多種昆蟲，是最常見的世界性昆蟲病原真菌，具有致病力強、殺蟲譜廣、易培養等特點，被廣泛用于農林害蟲的防治。我們團隊在云南蕉園發現自然罹病香蕉假莖象甲成蟲和蛹，經分離得到4株昆蟲病原真菌，本文通過形態學和ITS序列對其進行鑒定。對菌株的最適培養基、碳氮源、光照及溫度條件等生物學特性進行了研究，并初步探索其對香蕉假莖象甲的致病力，以期為生防菌劑的研發提供有效菌株.為今后香蕉假莖象甲的生物防控提供基礎數據。

1材料與方法

1.1蟲生真菌分離與純化

自云南省西雙版納州景洪市嘎灑鎮曼金龍村云南省農業科學院和國際生物多樣性中心聯合香蕉基地（21°54′N，100°48′E，海拔623.5m）和昆明市東川區因民鎮蕉園（26°19′N，102°55′E，海拔1042m）香蕉植株上發現罹病香蕉假莖象甲成蟲、蛹，將田間收集的罹病蟲體單頭存放于5mL離心管中帶回實驗室，進行分離鑒定。將罹病蟲體置于無菌培養皿中，5mL無菌水清洗表面，后轉入75%乙醇中浸泡5s，再用無菌水洗滌3次，后轉移至裝有滅菌濾紙的培養皿中2～3min，待帶菌蟲體表面水分充分晾干后，用鑷子將蟲體分成3～5塊，然后接種于PDA培養基上，置于（25±1）℃恒溫培養箱中培養，待平板上長出菌落后，對形態不一的菌落進行編號，按編號依次挑取菌落分別接種到新的平板上進行純化。

1.2菌株培養及形態觀察

在超凈工作臺中，用接種針將分離純化得到的菌株接種到PDA培養基上，置于（25±1）℃培養箱中培養，14 d和30 d后取出觀察菌落形態特征。

用刀片直接從平板上刮取少量菌絲（0.5 mm×0.5mm×0.1mm），用2.5%戊二醛溶液固定24 h，再于PBS中漂洗3次，每次15 min，去除樣品水分，臨界點干燥、噴金鍍膜后在掃描電子顯微鏡（日立Reguls 8100，日本）下觀察菌落菌絲形態、產孢結構和分生孢子形態等，并拍照記錄，根據菌株形態進行分類鑒定。

1.3菌株的分子生物學鑒定

參照Masoudi的方法提取真菌DNA，以菌株基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行菌株rDNA-ITS序列PCR擴增。PCR反應體系為50μL，其中上下游引物ITS1和ITS4各2μL，PCR MasterIix45μL，模板DNA 1μL。PCR反應條件：98℃預變性2min；98℃變性10s，72℃退火10s，72℃延伸5min，35個循環。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。測序結果通過NCBI數據庫進行比對，得到與目的菌株具有同源性的多個菌株的相應序列，從中下載相似性高的序列，使用MEGA 7.0軟件，通過鄰接法（neighbor-joining method，NJ），運行1000次bootstrap驗證，構建菌株系統發育樹。

1.4分離菌株的生物學特性測定

1.4.1溫度對菌株生長和產孢的影響

采用菌液點滴法將供試菌株的分生孢子用0.05%的Tween-80配成1.0×10⁸個／mL的孢子懸浮液，用移液槍吸取2μL菌液，接種到PDA培養基平板中央。將培養皿分別置于20、25、28℃和30℃的培養箱培養，每處理重復5次。分別在3、6、9、12、15 d和18 d采用“十字交叉法”用游標卡尺（0.01mm）測量菌落直徑，在18d時用直徑為0.5cm的打孔器分別在各菌落半徑1／2處打取菌碟，置于50 mL錐形瓶中，加入20 mL含0.05%Tween-80的無菌水，將錐形瓶放在磁力攪拌器上充分攪拌，用血球計數板（0.10mm，1／400mm²）測定孢子濃度并換算成單位面積分生孢子產量，得出最適培養溫度。

1.4.2光周期對菌株生長和產孢的影響

采用1.4.1的方法將4株菌株接種于PDA培養基中央，置于最適溫度，光周期分別為L∥D=12h∥12h、L∥D=24 h∥0h、L∥D=0h∥24h、L∥D=16h∥8h、L∥D=8h∥16h的培養箱中培養，每處理重復5次，于3、6、9、12、15d和18d測量菌落直徑，在18d時測定菌株的分生孢子產量。

1.4.3培養基對菌株生長和產孢的影響

將香蕉假莖象甲在104℃烘箱中烘干8h，用研缽將其研磨成粉，經8目篩子過篩，得到蟲粉。采用1.4.1的方法將4株菌株分別接種于PDA、SDAY、iPDA（即PDA+0.5%蟲粉）和iSDAY（即SDAY+O.5%蟲粉）培養基平板的中央。分別置于最適溫度和光照條件的培養箱中培養。每處理重復5次，于3、6、9、12、15d和18d測量菌落直徑，在18d時測定菌株的分生孢子產量。

1.4.4酸堿度對菌株生長和產孢的影響

采用1.4.1的方法將4株菌株分別接種于pH為6、7、8、9、10和11的PDA培養基中央，然后將培養基分別置于最適溫度和光照條件的培養箱中培養，每處理重復5次，于3、6、9、12、15 d和18 d測量菌落直徑，在18d時測定菌株的分生孢子產量。

1.4.5碳源對菌株生長和產孢的影響

參考王爽等的方法，在察氏培養基的基礎上，分別以蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇為唯一碳源，制成5種不同碳源（濃度均為30 g/L）的培養基，采用1.4.1的方法接種4個菌株到不同培養基上，每處理重復5次，將培養基置于最適溫度和光照條件的培養箱中培養，并于3、6、9、12、15 d和18 d測量菌落直徑，在18 d時測定菌株的分生孢子產量。

1.4.6氮源對菌株生長和產孢的影響

采用1.4.5的方法，在察氏培養基的基礎上，分別以蛋白胨、牛肉膏、硫氨酸和甘氨酸為唯一氮源（0.5g／L），制成4種不同氮源的供試培養基，采用1.4.1的方法接種菌株到不同培養基的中央，每處理重復5次，將培養基置于最適溫度和光照條件的培養箱中培養，并于3、6、9、12、15d和18d測量菌落直徑，在18 d時測定菌株的分生孢子產量。

1.5分離菌株的致病力測定

1.5.1孢子懸浮液的制備

將菌株Cs-1接種到PDA培養基上，在溫度為（25±1）℃，光周期L∥D=12 h∥12 h條件下培養15 d。菌株培養產孢后，用無菌刀片刮取菌落表面分生孢子到含0.04% Tween-80的無菌水溶液中，雙層無菌紗布過濾菌絲，在磁力攪拌器上充分攪拌使孢子均勻分散在溶液中，用血球計數板測定孢子濃度，并調配為1×10⁹、1×10⁷個／mL和1×10⁵個／mL的孢子懸浮液備用。

1.5.2供試香蕉假莖象甲的飼養

在蕉園捕獲香蕉假莖象甲成蟲，每50頭裝入一個無菌昆蟲培養盒（長：25.8cm，寬：18.2cm，高：11 cm）中。以健康香蕉假莖片為食物飼養蟲群，溫度為25℃，相對濕度為75%的全黑暗條件下在實驗室隔離飼養60 d，期間每2d補充1次新鮮香蕉假莖片并清理蟲盒中的殘食垃圾，每天觀察香蕉假莖象甲狀態，如果發現有死亡蟲體，立即用滅菌鑷子將蟲體取出，放于無菌培養皿中，并觀察昆蟲尸體是否是被真菌感染，同時對該培養盒進行消毒，并更換新鮮香蕉假莖片。在整個60 d期間只有沒有被感染跡象的昆蟲才被用于后期的接種試驗。

1.5.3菌株致病力測定

將室內飼養60 d后的健康成蟲先在無菌水中漂洗3次以去除植物殘留物，再于不同濃度分生孢子懸浮液中浸泡10 s。對照蟲群浸泡在含0.04%Tween-80無菌水中。然后將蟲群分別單獨放置在滅菌培養盒中（長：25.8 cm，寬：18.2cm，高：11cm），香蕉假莖片作為食物來源，溫度為25℃，相對濕度75%的黑暗條件下飼養25 d。每處理設置3次重復，每重復15頭。每天記錄死亡率，所有死亡蟲體用1%次氯酸鈉和70%乙醇進行表面消毒，并在滅菌水中漂洗3次，放于無菌培養皿中，每天定時觀察蟲體表面菌絲或分生孢子生長情況，鏡檢菌絲及分生孢子形態，判定是否為蘇格蘭白僵菌。

1.6數據分析

使用SPSS 22.0對菌落直徑及單位面積產孢量間的差異顯著性進行Duncan氏新復極差法檢驗，采用Probit方法求回歸方程及計算致死中濃度（LC₅₀）和致死中時（LT₅₀）。利用Origin 2021繪圖。

菌落直徑（mm）=（菌落橫徑+菌落縱徑）／2；

菌落單位面積產孢量（個／cm²）=每小格孢子數×400×10⁴×稀釋倍數／（3.14×r²×n），r為菌落半徑（cm），n為菌落的數量（塊）；

累計死亡率一（處理組累計死亡總蟲數／處理總蟲數）×100%;

校正累計死亡率=（處理組累計死亡率-對照組累計死亡率）／（1-對照組累計死亡率）×100%。

2結果與分析

2.1菌株形態特征

2.1.1田間特征

田間罹病的香蕉假莖象甲成蟲和蛹僵蟲發現于香蕉假莖外層，發病初期在蟲體體節、喙等部位附著白色濃密菌絲，伴隨菌絲不斷增多，逐漸覆蓋蟲體，最后產生大量白色粉狀孢子（圖1，圖2a～c）。

2.1.2菌株分離

共分離純化獲得4株病原真菌（表1）。將菌株接種于PDA培養基上，菌落呈白色，圓形，產孢后，表面呈奶油色，孢子層呈粉狀，菌落背面呈淡黃色（圖2d～g）。

2.1.3菌株形態特征

顯微鏡下菌絲無色光滑，直徑為1. 5～2.0μm，產孢細胞濃密簇生于菌絲、分生孢子梗或膨大的泡囊上，球形至瓶形，產孢細胞大小為（2.4～5.7）μm×（1.9～3.3）μm，產孢軸長約14μm，軸上具小齒突，呈膝狀彎曲。產孢細胞和泡囊常倍增，在分生孢子梗或菌絲上聚成相當密實的孢子頭。分生孢子無色，光滑，單細胞，多為短圓筒形，少為橢圓形，兩端通常鈍圓。分生孢子大小為（2.5～6.5）μm×（1.3～2.2）μm（圖3）。

2.2菌株rDNA-ITS序列分析

經測定，4株菌株rDNA-ITS的PCR擴增產物片段序列均為196 bp。以Cordyceps czcadae ARSEF7260 （HQ880757）為外群，采用neighbor-joining法構建系統發育進化樹（圖4）。比對結果顯示，分離的菌株Cs-l、Cs-2、Cs-3和Cs-5與菌株Beauveriacaledonica BCRC 32867（NR 077147.1：7-471）處于進化樹最小分支，親緣關系最近，相似性分別高達99.35%、99.36%、99.45%和99.78%。因此，綜合形態學分析和rDNA-ITS序列相似性分析，將該菌株確定為蘇格蘭白僵菌Beauoeria caledonica。

2.3不同培養條件對菌株生長及產孢的影響

2.3.1不同培養條件對菌株生長的影響

不同光照條件對菌株生長的影響試驗顯示，4株蘇格蘭白僵菌菌株在L∥D=12 h∥12 h、L∥D=24 h∥0h、L∥D=O h∥24 h、L∥D=16 h∥8h、L∥D=8 h∥16h條件下均可生長，培養18 d，Cs-1、Cs-2和Cs-3在光周期為L∥D=24 h∥0h條件下時菌落直徑最大，直徑分別為（54.03±0.65） （50.94±3.32）mm和（50.94±3.32） mm，均顯著高于L∥D=O h∥24 h條件下的菌落直徑；Cs-5在光照條件為L∥D=8 h∥16 h下直徑最大，為（48.67±1.26） mm，但與L∥D=24 h∥0h條件下的直徑無顯著差異；綜上，在L∥D=0h∥24h下培養18d，4個菌株直徑均顯著低于有光條件下菌落直徑，但是在有光照的條件中差異不大。綜上，適當的補充光照可促進蘇格蘭白僵菌的生長（圖5）。

通過設置不同的培養溫度得出，4株蘇格蘭白僵菌菌株在20、25℃和28℃下均可生長，但是當溫度升高到30℃時4株菌株均停止生長。28℃時，雖然菌株都有一定程度的生長，但是到6d后菌落直徑都顯著低于20℃和25℃條件下的菌落直徑；當培養到18d時，4個菌株在25℃條件下的菌落直徑分別達到（64.25±1.40） （57.41±1.69） （55.33±1.12） mm和（63.05±1.63） mm，顯著高于其余3個溫度條件下的直徑。綜上，4株菌株的最適生長溫度均在25℃左右，溫度過高會抑制其生長，甚至使菌株失活（圖6）。

培養基對蘇格蘭白僵菌生長的影響結果顯示，相對于SDAY培養基，PDA培養基更適合蘇格蘭白僵菌的生長，同時，加入蟲粉對兩種培養基均起到促進作用；到18d時，4株菌株在iPDA培養基上菌落直徑最大，分別達到（65.17±0.74） （60.21±3.26） （56.99±0.46） mm和（63.17±0.7） mm;其中Cs-1、Cs-2和Cs-5在iPDA和PDA培養基上菌落直徑沒有顯著差異，Cs-3菌株在iPDA培養基上的菌落直徑顯著高于PDA培養基；菌株在iPDA和PDA培養基上培養18d菌落直徑均顯著高于另外2種培養基。綜上，PDA培養基更適合蘇格蘭白僵菌的生長，同時，適當加入香蕉假莖象甲蟲粉有利于菌株的生長（圖7）。

碳氮源也是影響生長的重要條件，5種不同的碳源條件中，以乳糖作為唯一碳源更適合4株蘇格蘭白僵菌菌株生長，Cs-1、Cs-3和Cs-5在18 d時菌落直徑均顯著高于其他處理，菌株Cs-2乳糖和蔗糖處理顯著高于其他處理，乳糖和蔗糖之間差異不顯著。18 d時，以乳糖為唯一碳源的培養基上，4株蘇格蘭白僵菌菌落直徑分別為（30.67±0.37） （28.28±1.06）（29.53±0.88）mm和（37.44±1.04）mm（圖8）。

在以甘氨酸、硫氨酸、蛋白胨和牛肉膏為唯一氮源的條件下，18 d時，4株蘇格蘭白僵菌在以牛肉膏為唯一氮源條件下菌落直徑分別為（34.47±0.51）（36.74±1.01） （35.20±1.64）mm和（41.80±0.86）mm，顯著高于其他3種氮源；甘氨酸和硫氨酸條件下4株菌株直徑均顯著低于牛肉膏和蛋白胨（圖9）。綜上，乳糖和牛肉膏分別作為碳氮源更加適合蘇格蘭白僵菌的生長。

在不同pH條件下，培養18d時，Cs-1在pH11處理中的菌落直徑顯著低于其他處理，pH 10條件下菌落直徑顯著低于pH 8，但是其他處理間均沒有顯著差異；Cs-2在pH為7和9條件下菌落直徑顯著高于其他處理，但是2個處理之間沒有顯著差異；Cs-3在pH為6時菌落直徑顯著低于其他處理；Cs-5在pH11時菌落直徑最低。但結合4株菌株18d時的菌落直徑，差異均較小，并缺乏規律性，因此表明，4株蘇格蘭白僵菌對pH的變化不敏感（圖10）。