番茄斑萎病毒的分離鑒定與抗性煙草種質篩選

摘要 番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）是危害云南和四川煙草生產的主要病毒種類之一。本文通過分子生物學檢測和苗期汁液摩擦接種，鑒定了云南保山隆陽和四川涼山鹽源的煙草分離物毒株、病害表型和主栽品種抗性。結果顯示：TSWV保山和涼山分離物在分子進化上與多個云南煙草TSWV分離物同源性較高，序列相似性達99.43%。分離物引起的典型癥狀為不對稱損傷，半邊葉上出現點狀密集壞死，頂部心葉變灰壞死，半側莖稈環斑狀凹陷壞死、其對應髓部變黑。在供試的24份煙草種質中，烤煙品種‘K326‘NC89’‘G28’‘云煙85’‘云煙87’‘云煙105’‘云煙116’‘紅大’‘中煙100’，抗TMV的N基因型野生煙黏毛煙草Nicotiana glutinosa和‘SamsunNN’，抗PVY的va基因型煙草‘VAM’，均對TSWV表現感病；野生煙花煙草N. alata高抗TSWV，且兼抗煙草花葉病毒（tobacco mosaic vlrus，TMV），是抗病育種的重要基因資源。

關鍵詞 番茄斑萎病毒；抗病性；鑒定；煙草

中圖分類號：S 435.72 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2024103

番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）最早在澳大利亞番茄上被鑒定，是正番茄斑萎病毒屬Orthotos povirus重要成員，主要靠薊馬持久性傳播和汁液摩擦傳染，能侵染包括茄科Solanaceae、豆科Fabaceae、菊科Asteraceae和葫蘆科Cucurbita-ceae在內的360余種植物，嚴重危害番茄、煙草、辣椒、馬鈴薯、花生、萵苣、鳳仙花等作物。煙草斑萎病癥狀最早在南非煙草上被描述，1986年首次在格魯吉亞烤煙中診斷出TSWV，1989年美國佐治亞州所有煙草種植縣都有TSWV發生，之后，澳大利亞、歐洲、南非、北美和亞洲均報道TSWV在煙草上流行危害。中國1992年首次在四川曬煙上報道了TSWV，此后TSWV的危害范圍逐年擴大，云南、貴州、黑龍江、山東等地區種植的烤煙上均有發生。

TSWV世界分布，在世界十大重要植物病毒中排名第2位，在許多煙草生產國以不同程度發生危害。在美國、保加利亞、匈牙利、波蘭、希臘危害較重，在亞洲和大洋洲呈上升趨勢，被各主要產煙國公認為最具潛在威脅的病毒。

煙屬TSWV抗源來自野生煙花煙草Nicotiana alata的一對顯性等位基因，波蘭學者通過小孢子原生質體融合技術將其中的抗病基因轉移到栽培煙草N.tabacum，育成較抗TSWV的香料煙‘Polata’。但因N.alata的不育性和種間雜交不親和的限制，尚無抗性較強的烤煙品種，主栽烤煙品種‘NC78’‘K326‘G28’‘NC89'云煙87’等高感TSWV。本文采用分子生物學檢測和苗期接種的方法，研究了云南保山和四川涼山煙草TSWV毒株、病害癥狀和主栽品種抗病性，以期鑒定抗病種質。

1材料與方法

1.1材料

TSWV的枯斑寄主：矮牽牛Petunia×atkinsi-ana；繁殖寄主：本氏煙Nicotiana benthamiana；野生煙：包括抗TMV的N基因型煙草花煙草N.ala-ta、夜花煙草N.noctiflora和黏毛煙草N.glu-tinosa；普通煙草N.tabacum栽培種：包括抗TMV的N基因型煙草品種‘Samsun NN’和‘CV91’，抗PVY的va基因型煙草品種‘VAM’，以及Sam-sun nn’‘革新三號’‘G140’‘紅大’‘G28’‘亮黃’‘鐵耙子’‘Ti245’‘云煙85’‘NC95’‘K326’‘NC89’‘云煙87’‘中煙100’‘云煙105’‘云煙116’‘TI1203’‘X45’，所有材料來源于中國農業科學院煙草研究所和云南省煙草公司保山市公司。

1.2 TSWV分離物純化與擴繁

2022年-2023年于云南保山隆陽和四川涼山鹽源煙田（種植品種均為‘云煙87’），采集半邊葉上點狀密集壞死、不對稱損傷的病葉，汁液摩擦接種在枯斑寄主矮牽牛上，分離純化后，接種在5～6葉期繁殖寄主本氏煙上，接種后5～8d取褪綠斑駁、反卷皺縮的上部葉，制備接種物或-70℃保存。

1.3外殼蛋白擴增與毒株鑒定

根據已報道的云南煙草TSWV分離物的核衣殼蛋白序列（HQ402595），設計擴增TSWV N基因的引物和病毒檢測引物（表1）。對云南保山隆陽和四川涼山鹽源采集的病葉，分別提取總RNA、反轉錄、PCR擴增、凝膠回收、克隆及測序。將序列提交NCBI進行BLAST比對。

1.4TSWV接種液制備及寄主苗齡篩選

TSWV經純化后保存于本氏煙。取本氏煙病葉1g研磨后裝入離心管中，加入1mL磷酸緩沖液（0.01 mol／L、pH 7.2），離心后取上清作為TSWV接種母液，再稀釋10、20、40、80、160、240倍。分別接種在枯斑寄主矮牽牛和系統寄主‘TI1203’上，7～10 d后根據矮牽牛接種葉上的枯斑密度和‘TI1203’發病率及病害嚴重度，篩選接種物稀釋倍數。在3～4、5～6、7～8葉期‘TI1203’煙苗上接種40倍TSWV汁液，10～14 d后根據發病率，篩選適宜接種的苗齡。上述每處理15株、重復3次。

1.5品種抗病性鑒定

1.5.1煙草培育與接種

于防蟲日光溫室中播種育苗，3～4片真葉時假植到直徑8cm小花盆或16～20孔聯體塑料盤內，每品種≥45株，隨機擺放在培養架上或育苗畦內。

工具和雙手用肥皂消毒后，制備20～40倍病毒汁液。置于冰上保持侵染力。

在5～6葉期煙苗上勻撒600目石英砂。一手托葉片，另一手用棉棒蘸取適量接種液，順葉脈方向輕輕摩擦上部2片展開葉，每蘸取1次接種1株；或采用衣刷對育苗畦內煙苗進行接種，每蘸取1次順向摩擦2次。接種后噴灑清水，25～27℃培養。

1.5.2病級劃分與病情調查

依據病癥發展過程，參考GB/T 23222煙草病蟲害分級及調查方法，以株為單位記載TSWV病害嚴重度級別。0級，全株無病；1級，病葉半邊葉上出現點狀密集壞死，病株無明顯矮化；3級，1／3病葉半邊葉上出現點狀密集壞死，并伴隨病葉不對稱生長，或病株矮化為正常株高的3／4以上；5級，1／3～1／2病葉不對稱生長，或頂部心葉出現整葉壞死，頂芽向一側壞死傾倒，或病株矮化為正常株高的2／3～3/4；7級，1／2～2/3病葉不對稱生長，或頂芽壞死側倒，莖稈上有明顯的凹陷壞死癥狀，且對應部位的髓部變黑，或病株矮化為正常株高的1／2～2／3；9級，全株病葉不對稱生長，頂芽嚴重壞死，或病株矮化為正常株高的1／2以下。

接種后7～10 d調查發病率，14～21 d逐株調查發病級別。

2結果與分析

2.1煙草TSWV病害表型及純化保存

煙株感染TSWV后首先在半邊葉上出現點狀密集壞死，隨后葉片出現不對稱損傷或生長、心葉變灰壞死，最后莖稈一側環斑狀凹陷壞死、對應髓部變黑，頂芽壞死側倒、病株矮化。矮牽牛接種TSWV后5～7d，接種葉出現大的褐色局部斑，病毒不系統擴展，取單斑進行病毒分離純化后接種5～6葉期本氏煙，7～10d后接種葉出現局部黃化斑，心葉向下卷曲皺縮且一側較重，隨即頂芽半邊壞死側倒，需及時采集病葉冷凍保存（圖1）。

2.2煙草TSWV分離物的鑒定

用擴增病毒核衣殼蛋白基因（N）的引物對采自保山隆陽和涼山鹽源的煙草病葉進行RT-PCR檢測。結果顯示：擴增產物大小837 bp，克隆測序表明，該序列包含N基因編碼的258個氨基酸的核衣殼蛋白全長（774 bp）（圖2）。通過BLAST比對顯示：TSWV核衣殼蛋白N序列較為保守，保山和涼山分離物的核衣殼蛋白N序列與多個云南分離物同源性較高，序列相似性達99.43%。

2.3TSWV接種物的適宜稀釋倍數和寄主苗齡

用10～240倍病毒汁液接種矮牽牛和‘TI1203’，接種160倍病毒汁液時，矮牽牛上的枯斑數目顯著降低，稀釋至240倍時已不具備侵染力（圖3a）。‘TI1203’的發病率和發病級別隨稀釋倍數的增加而逐漸降低，10～80倍病毒汁液在5～6葉期‘TI1203’上產生系統性病癥，但稀釋倍數較低時，上部非接種葉出現半邊點狀密集壞死和不對稱生長后，很快頂芽壞死側倒、整株死亡，接種物稀釋倍數以20～40倍為宜。

‘TI1203’不同苗齡煙苗在接種40倍TSWV病毒汁液后，苗齡越小發病越快，部分5～6葉期前期顯癥充分的病株，后期會新生健康葉，該現象在長勢較強的煙株上尤為普遍。且7～8葉期煙苗，僅在接種葉上出現壞死性環斑，未發展成心葉的系統壞死，顯示煙株苗齡顯著影響發病率、顯癥快慢和發病級別（圖3b），適宜接種苗齡為5～6葉期。

2.4不同品種煙草苗期接種TSWV的癥狀與品種抗性

在溫室內，5～6葉期煙苗接種TSWV后其癥狀發展過程為：首先在幼嫩接種葉上引起同心輪紋和帶狀壞死斑點和斑紋，有時葉片上可密布小的壞死環，這些環常合并為大斑，形成不規則的壞死區，壞死區初為淡黃色，后變為褐色；然后上部系統葉先是半邊自基部開始出現點狀密集壞死，后逐漸擴展至葉尖和另一側；最后葉片表現不對稱損傷和生長，向一側扭曲，很快頂芽壞死側倒（圖4）。

供試烤煙品種‘G28‘K326‘NC89’‘中煙100’‘云煙87’‘紅大’‘云煙105’‘云煙116’等，對TSWV表現不同程度的感病。抗TMV的N基因型煙草N.glutinosa‘Samsun NN’‘CV91’，以及抗PVY的va基因型煙草‘VAM’，對TSWV均無顯著抗性。此外，湄潭曬煙‘X45’和煙屬野生種夜花煙草N.noctiflora接種后亦表現感病；野生煙花煙草N.alata接種TSWV后不顯病癥，表現高抗（表2）。

為進一步明確抗性鑒定結果是否準確，選擇對TSWV表現免疫的花煙草N.alata和表現感病的夜花煙草N.noctiflora進行RT-PCR驗證，確定其接種葉和非接種葉中是否含有TSWV，結果顯示，接種TSWV后8d，花煙草N.alata接種葉片和上部非接種葉片均不表現病癥，RT-PCR也均未檢測到病毒。夜花煙草N.noctiflora接種后出現明顯系統性癥狀，其接種葉片和上部非接種的系統葉片中均檢測到病毒（圖5）。

3結論與討論

TSWV是危害云南和四川煙草的主要病毒種類之一。感染TSWV的典型病株為不對稱損傷和半邊葉上點狀密集壞死。本研究中的云南和四川煙草TSWV分離物相似性達99.43%；主栽烤煙品種對TSWV無明顯抗性，野生煙花煙草N.alata高抗TSWV，且兼抗TMV，是抗病育種的重要基因資源。

煙屬野生種含豐富的抗病資源。國際煙草合作組織CORESTA報道N.alata在3葉期后對TSWV抗性明顯，其抗性是受一對顯性等位基因RTSW控制的過敏反應，并利用其抗性育成香料煙‘Polata’，其不僅抗TSWV，且連鎖兼抗煙草根黑腐病菌Thielaviopsis basicola和馬鈴薯Y病毒（pota-to virus Y，PVY）N株系。在抗病（N.alata和‘Polata’）和感病（‘紅大’和‘K326’）煙葉中瞬時表達TSWV的5個功能基因NSm、NSs、N、Gn、Gc，借助過敏反應，鑒定出抗病基因RTSW對應的無毒基因為NSm；繼而利用NSm瞬時過表達和寄主過敏反應，鑒定含RTSW抗性位點的煙草品種。但因種間雜交親和性的應用局限，雜交育種中少見N.alata抗性的應用。

本研究中的烤煙品種‘云煙87’‘紅大’‘NC89’‘中煙100’，N基因型N.glutinosa‘Samsun NN’‘CV91’，以及va基因型‘VAM’，均對TSWV表現感病。N.alata接種后不僅不顯癥，而且RT-PCR亦檢測不到接種葉和上部非接種葉中存在病毒，這不同于前人報道的過敏反應，可能與N.alata不育性和來源不同有關，其抗性機制正在通過抗性遺傳和抗病基因的克隆來確認。此外，夜花煙草N.noctiflora接種后感病，亦不同于前人測定的顯示完全抗性，這可能與煙草種質或病毒毒株的來源不同有關。

在煙草苗期接種病毒的試驗中，毒株、苗齡、溫度、接種濃度等諸多因素，均會影響病害表型，不同的試驗材料和抗病性鑒定方法，可能對同一品種的抗性遺傳得出有差異的評價。本研究系統表述了抗TSWV煙草品種的篩選和檢測，研究結果有助于不同鑒定單位的橫縱比較和抗病基因的鑒定。