銀杏外種皮提取物對棉鈴蟲的殺蟲活性及對煙葉品質和土壤酶活性的影響

摘要 為探究銀杏外種皮（Ginkgo biloba sarcotesta，Gbs）提取物對棉鈴蟲Helicoverpa armigera的防治效果及對煙草幼苗生長、煙葉品質、土壤酶活性的影響，本研究測定和比較了不同濃度（2、4、8mg／mL）銀杏外種皮醇、水提取物作用下棉鈴蟲幼蟲的校正死亡率，及其煙苗生長、煙葉品質、土壤酶活性等相關指標。結果表明，銀杏外種皮的醇或水提物對棉鈴蟲幼蟲均具有良好的殺蟲活性，8 mg／mL的醇、水提取物持續處理60h后，幼蟲校正死亡率分別為65.8%、48.9%；醇提物對煙草幼苗株高、鮮重、干重均有一定促進效應，但水提物對煙草幼苗的促生長作用不顯著；醇、水提取物均顯著提升了煙葉的可溶性糖及總糖含量，但對煙堿含量影響不顯著；相同噴施濃度和處理時長時，醇提物對棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性，對煙草幼苗生長、煙葉品質的影響較水提物更明顯；銀杏外種皮的醇、水提取物均未導致土壤酶活性發生顯著變化。結果表明，銀杏外種皮醇與水提物在不影響土壤酶活性條件下，可對棉鈴蟲幼蟲表現出良好防治效果并在一定程度上提升煙葉的品質，因此在防治煙草棉鈴蟲中具有一定應用潛力。

關鍵詞 銀杏外種皮；棉鈴蟲；校正死亡率；煙葉品質；土壤酶活性

中圖分類號：Q 945.1；S 433.4 文獻標識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024115

棉鈴蟲Helicoverpa armigera是世界范圍廣發性鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae農業害蟲，其啃食作物葉片影響植株正常生長發育進程。煙草是棉鈴蟲的主要為害對象，各國每年因棉鈴蟲導致的煙草減產減收損失巨大。研究表明，每株煙草接蟲數量為7頭時，產量損失率和經濟損失率分別可達10.42%和23.89%，因此及時有效對煙草棉鈴蟲進行防控十分必要。但長期施用化學農藥來防治棉鈴蟲會導致蟲體抗藥性增強、土壤改性、水源污染、生物鏈破壞等問題，威脅到生態平衡和農業可持續發展‘2]。

植物源農藥可降解、少殘留、不易導致抗藥性、不隨食物鏈富集等優點使其成為各國研究熱點。核桃楸Juglans mandshurica、菖蒲Acorus cala-mus、苦皮藤Celastrus angulatus等眾多植物提取物被證明對農業害蟲具有觸殺、胃毒、拒食、殺卵和生長抑制效應。但值得注意的是，即使是同一植物提取物的不同極性部位對同一害蟲的殺蟲活性也可能差異顯著，如杏仁提取物氯仿萃取部位對綠盲蝽Apolygus lucorum觸殺活性顯著高于其他溶劑萃取部位。藜蘆堿、苦參堿、除蟲菊素、澤蘭二酮、魚藤酮、苦楝素等植物提取物的活性單體已被成功分離純化，并對為害蘋果、蔬菜等農作物的繡線菊蚜Aphis citricola、黏蟲Mythimna separata、黃曲條跳甲Phyllotreta striolata、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda等害蟲表現出良好的防效，這為后續基于活性單體的生物農藥配方優化、結構修飾等創造了條件。噴施植物提取物防控農業害蟲時，可能誘發被施植物產生不同程度的生理響應，導致植株生長發育、物質代謝、生理進程、活性成分等發生顯著變化，如駱駝蓬Peganum harrnala和銀杏Ginkgo biloba提取物促進了玉米和小麥種子萌發及幼苗生長，無患子Sapindus saponaria落葉浸提液明顯促進了委陵菜Potentilla chinensis幼苗生長；噴施植物提取物還可能會不同程度影響（激活或抑制）表征土壤肥力的蔗糖酶、脲酶等酶的活力。煙草是以葉片為最終收獲對象的經濟作物，噴施植物提取物對其植株生長、煙葉品質及土壤酶活會產生怎樣的影響值得關注。

銀杏外種皮（Ginkgo biloba sarcotesta，Gbs）的醇、石油醚等有機溶劑提取物對農業害蟲及病原體寄主釘螺Oncomelania hupensis等殺蟲活性顯著，銀杏主產區常利用其外種皮作土農藥使用，可見Gbs具有生物農藥開發潛力。已有研究發現，銀杏外種皮乙醇提取物對鱗翅目農業害蟲小菜蛾Plutella xylostella表現出了良好殺蟲活性，且殺蟲活性在一定范圍內表現出提取物濃度及處理時長依賴性。那么，銀杏外種皮提取物對同屬鱗翅目的農業害蟲棉鈴蟲殺蟲活性如何，提取物施用會對煙草幼苗生長、煙葉品質、土壤酶活力產生怎樣的影響，不同溶劑提取物對棉鈴蟲殺蟲活性，對煙葉品質、土壤酶活性的影響是否存在顯著差異均有待進一步研究。基于此，本研究擬測試銀杏外種皮醇、水提取物作用下的棉鈴蟲校正死亡率，探討其對煙草幼苗生長、煙葉品質、土壤酶活力的影響，以期為銀杏外種皮提取物在鱗翅目農業害蟲防治中的開發利用提供試驗依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

2022年11月在永州市雙牌縣桐子坳（111.65°E，25.97°N）采集銀杏外種皮，清洗和瀝干后，60℃烘至恒重，經化學與生物工程學院植物學博士黃國文鑒定無誤。棉鈴蟲卵購于河南省科云生物農藥有限公司，孵化后挑選生命狀態良好、蟲體大小一致的3齡幼蟲用于試驗。煙草幼苗為湖南省煙草公司永州市分公司提供的‘云煙87’，選長勢均勻一致的煙草幼苗移栽至80cm×30cm×30cm育苗盆中，盆內土壤采自校園周邊空地。

1.2試驗方法

1.2.1提取物制備

銀杏外種皮烘至恒重后打粉過80目篩，分別稱取200g粉末置大燒杯，各加95%乙醇或純凈水1500mL，400W微波持續處理60s，3000r／min離心10 min，抽濾、減壓濃縮至稠膏狀后40℃烘至恒重。分別稱取0.2、0.4、0.8g醇、水提取物，對應用95%乙醇或純凈水溶解并定容至100mL，得到濃度分別為2.0、4.0、8.0 mg／mL的銀杏外種皮提取液，并將不同濃度提取液置于不同容量瓶中備用。

1.2.2棉鈴蟲培養及給藥處理

選用幼苗的鮮嫩煙葉，用打孔器打取直徑1cm的葉碟，置于醇提液與水提液中浸泡10 s后取出晾干，放入墊有濕潤濾紙的培養皿中；挑選形態大小基本一致且饑餓處理2h的3齡棉鈴蟲幼蟲置于培養皿中，每皿20頭，每12 h清理培養皿更換經提取物浸泡并晾干的新鮮葉片；以相應溶劑作空白對照，對照組及處理組均設置3個重復，每間隔12 h進行1次死亡蟲數統計，直至死亡蟲數不再增加，并根據公式計算校正死亡率。

校正死亡率=[（對照組存活率-處理組存活率）／對照組存活率]×100%;

存活率=[1-（處理后棉鈴蟲死亡數／供試棉鈴蟲數）]×100%。

1.2.3煙苗噴藥處理

煙苗長至3片真葉時，選擇長勢均勻的煙苗移栽至24個育苗盆中，每盆約50株，移栽定植后第5天下午6：00分別以純凈水、95%乙醇，2、4、8 mg／mL的醇或水提液噴灑幼苗，每處理3盆，每24 h噴1次，共噴3次，每次用量恒定為1L，均勻噴到幼苗葉片至濕潤。

1.2.4煙草幼苗生理與生長指標測定

最后1次噴藥后第3天上午9：00進行光合速率、POD活性、MDA含量測定。凈光合速率測定時選取煙株第3片真葉為測試對象，POD活性和MDA含量隨機采摘部分煙葉測定。噴藥處理后第30天上午9：00，隨機選取對照組與處理組幼苗各5株，分別用直尺測定各組所有幼苗株高（cm）后求平均值；然后從葉柄處分別剪下各組所有幼苗葉片，用電子天平測定總鮮重（g）后求得單株葉片鮮重；再把各組采集的新鮮葉片分別置100℃烘箱殺青10 min，60℃烘至恒重，用電子天平稱重后求得單株葉片干重（g）；所有指標均重復測定3次求得平均值。

1.2.5煙葉品質測定

最后1次噴藥后第5天上午9：00，隨機采摘部分煙葉60℃烘干研磨，測定煙葉總糖、還原糖、煙堿含量。測定總糖與還原糖時，用1mg／mL葡萄糖標準溶液稀釋形成濃度梯度后，分光光度法制得標準曲線；再分別稱取100 mg煙葉粉末置100 mL試管中，加80%乙醇10mL過夜后加入熱蒸餾水10 mL，80℃水浴0.5h，過濾至100 mL容量瓶中，熱蒸餾水反復沖洗濾渣，定容得還原糖待測液。吸取上述還原糖待測液25 mL于250 mL三角瓶中，并加入1：3（濃鹽酸與蒸餾水體積比）鹽酸溶液7 mL，置沸水中酸化0.5 h，加1～2滴甲基紅指示劑，10% NaOH調至中性或偏堿性（pH=7.0～7.5），轉移到100 mL容量瓶定容得總糖待測液。分別取還原糖、總糖待測液2 mL，加入3，5-二硝基水楊酸顯色劑2 mL，紫外一可見光分光光度計測定吸光度后從標準曲線上查出對應還原糖濃度（C₁）與總糖濃度（C₂），根據公式計算還原糖、總糖含量。

還原糖含量=C₁×100 mL／100 mg；

總糖含量=C₂×250 mL×4／100 mg。

測定煙堿含量時，各組稱取100 mg煙葉粉末于100 mL具塞三角瓶，加50 mL三氯甲烷振蕩萃取30 min，過濾萃取液置100 mL容量瓶，三氯甲烷定容得待測液。以水為對照，紫外分光光度計240、259、282 nm測待測液吸光度，根據公式計算煙堿含量。

C= （0.0807+0.4269×OD₂₅₉+0.4739×OD₂₄₀-0.6312×OD₂₈₂）×V/m。

式中C為煙堿含量（%），OD₂₅₉、OD₂₄₀和OD₂₈₂分別為待測液吸光度，V為樣品溶液體積（mL），m為煙樣質量（mg）。

1.2.6土壤酶活性測定

最后1次施藥后第7天進行土壤酶活性測定。蔗糖酶活性測定時，分別稱“1.2.3”中對照組和處理組幼苗根際鮮土3g，置于三角瓶中，加入10 mL 8%蔗糖溶液，10 mL pH 5.5的磷酸緩沖液和2滴甲苯，恒溫箱內37℃培養24 h后過濾。取0.5 mL濾液到50 mL容量瓶中，加3 mL 3，5-二硝基水楊酸后水浴加熱5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至50 mL，508 nm處測吸光度，計算蔗糖酶活性，酶活以24 h后1g土壤中葡萄糖的毫克數表示。

脲酶活性測定時，分別稱取“1.2.3”中對照組和處理組幼苗根際鮮土2.5g，置于150 mL三角瓶中，加1 mL甲苯，5 mL 10%尿素液和10 mL檸檬酸鹽緩沖液。于37℃的恒溫箱中培養24 h后過濾，取1 mL濾液于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至20 mL后加4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液，搖勻后定容。用分光光度計測定578 nm處吸光度并計算土壤脲酶活性，酶活以24 h后1g土壤中NH3 -N的毫克數表示。

過氧化氫酶活性測定時，分別稱取“1.2.3”中對照組和處理組幼苗根際鮮土2.5 g，置于150 mL三角瓶中，每個樣稱2份。向瓶中加入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫溶液，振蕩20 min。而后加入5 mL 3 mol／L硫酸。再將瓶中懸液過濾后吸15 mL濾液，用0.1000 mol／L高錳酸鉀溶液滴定至粉紅色為終點并計算過氧化氫酶活性，酶活以20 min后1g土壤消耗的0.1000 mol／L高錳酸鉀溶液的毫升數表示。

1.3數據處理

煙草幼苗生長指標及葉片生理指標等數據經Excel 2003進行整理和分析，計算得到平均值及標準差，通過SPSS19.0進行單因素方差分析及多重比較，利用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2結果與分析

2.1銀杏外種皮提取物對棉鈴蟲的滅殺活性

如圖1所示，銀杏外種皮醇提物與水提物均對棉鈴蟲幼蟲表現出一定殺蟲活性，且蟲體對2種提取物的響應速度較快，醇提物和水提物分別在處理后12、24 h即表現出殺蟲效果。醇提物和水提物的濃度相同時，棉鈴蟲的校正死亡率均隨處理時間延長而逐漸增加，但醇提物在各個時間節點下收獲的棉鈴蟲校正死亡率均不同程度優于水提物。不同濃度處理組在持續處理60 h后，校正死亡率達到最大值后不再顯著變化。同一提取物作用下，當持續時間相同時，棉鈴蟲校正死亡率在所設濃度范圍內隨提取物濃度增加呈增加趨勢。醇、水提物均在8 mg／mL濃度處理60 h時達到各自最佳校正死亡率，分別為65.8%、48.9%。

2.2銀杏外種皮提取物對煙葉幼苗生長與生理的影響

銀杏外種皮醇提物對煙草幼苗的生長表現出一定的促進效應。處理濃度為4 mg／mL時，植株的株高、葉鮮重、葉干重較對照組均出現不同程度增加（Plt;0.05），且當提取物濃度增加，各指標相較對照組的增幅更大（表1，圖2）。與醇提物不同，水提物噴施處理未導致幼苗上述生長指標發生顯著變化，未對煙草幼苗表現出明顯的生長促進效應（Pgt;0.05）。

對比銀杏外種皮提取物噴施后煙草幼苗的生理響應發現（表2），不管是醇提物還是水提物處理，幼苗葉片的MDA含量與POD活性較對應的醇、水對照組，均未隨提取物濃度增加出現顯著變化（Pgt;0.05）。相同濃度條件下，幼苗葉片中MDA含量、POD活性在2種提取物之間差異不顯著（Pgt;0.05）。醇提物和水提物的噴施處理均提高了煙苗葉片凈光合速率，且提取物濃度從2mg／mL增加到4mg／mL時，煙草葉片凈光合速也呈增加趨勢。4mg／mL濃度后葉片光合速率維持穩定，且4、8mg／mL醇提取物處理組植株葉片凈光合速率顯著高于水提物（Plt;0.05）。

2.3銀杏外種皮提取物對煙葉品質指標的影響

銀杏外種皮的醇提物與水提物處理下，除2mg／mL濃度水提物組外，其他各處理組煙葉可溶性糖、總糖含量較對照組均顯著增加（Plt;0.05）。隨著2種提取物濃度的升高，可溶性糖與總糖含量相對對照組的變化越明顯；提取物濃度相同時，醇提物對各指標的影響較水提物更明顯。與可溶性糖等指標不同，醇提物與水提物均未顯著改變葉片中的煙堿含量（Pgt;0.05）（圖3）。

2.4銀杏外種皮提取物對土壤酶活性的影響

煙草幼苗土壤中常見的重要酶活測定結果如表3所示。所得數據經統計學分析發現，銀杏外種皮醇提物和水提物處理均未對土壤中蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶的活性產生顯著影響，各指標測定結果在對照組與各處理組之間無顯著差異（Pgt;0.05）。

3結論與討論

化學農藥在人類農業生產中發揮著極其重要的作用，但其殘留與污染等問題不容小覷，植物源農藥可顯著減少化學農藥使用帶來的危害而成為各國學者的研究熱點。我國可用于生物農藥開發的植物資源十分豐富，僅河南一省可用于農藥開發的種子植物就有63科133屬190種。常作為我國農村地區土農藥的銀杏外種皮含白果醇、棕櫚酮、白果酸等活性成分，是一種優質植物源生物農藥開發原料，但目前未得到很好利用，每年以萬噸計被直接廢棄。

銀杏外種皮提取物對水稻紋枯病菌Rhizocto-nia solani、黃瓜炭疽病菌Colletotrichum orbicu-lare、番茄青枯病菌Pseudomonas solanacearum等病原菌，以及球黑孢霉Nigrospora sphaerica、鏈格孢alternaria alternata等真菌均有明顯生長抑制效應，對常見農業害蟲小菜蛾、菜青蟲Pieris rapae、桑蟥Rondotia menczana、蘿卜蚜Lipaphis erysimi等也有顯著防控效應。基于可被銀杏外種皮提取物有效滅殺的農業害蟲大部分屬于鱗翅目，可推測銀杏外種皮提取物在鱗翅目農業害蟲防治中具有較好普適性。本研究發現，銀杏外種皮提取物對同屬于鱗翅目的棉鈴蟲幼蟲也表現出顯著致死效果為此推測提供了新證據，且結果發現醇提物效果優于水提物。與團隊先前所開展的提取物滅殺小菜蛾效果進行比較可知，相同濃度（2、4、8 mg／mL）銀杏外種皮醇提物作用下，棉鈴蟲幼蟲對提取物敏感度低于小菜蛾，表現為棉鈴蟲幼蟲出現死亡的時間較小菜蛾更晚，棉鈴蟲幼蟲校正死亡率上升趨勢更緩，棉鈴蟲幼蟲最高校正死亡率更低等方面。這些發現可為銀杏外種皮提取物后續產業化生產，及其在農業生產中的施用提供試驗依據。

農藥施用到農作物植株葉片等部位后，其在發揮防控農業病蟲害作用的同時，也會不同程度地影響被施農作物的個體生長發育與生理機能。研究發現，適當濃度的銀杏外種皮提取液處理能夠顯著促進桑樹枝條生長，提高桑葉產量與質量。本研究發現，雖然銀杏外種皮的水提物未對煙草幼苗的生長產生顯著影響，但醇提物對煙草幼苗的株高、鮮重、干重表現出了顯著的促進效應，這與我們之前研究發現銀杏與垂序商陸Phytolacca americana醇提取的復配劑對十字花科植物幼苗生長具有抑制作用的結果相反，提示復配劑中抑制十字花科植物生長的活性物質可能來源復配劑中的垂序商陸提取物。本研究還發現，銀杏外種皮醇與水提物未引發顯著的煙草幼苗應激響應，且在一定濃度范圍內可提升煙苗葉片凈光合速率和品質指標，如可溶性糖與總糖含量等，說明提取物進入煙草葉片后對葉內組織結構與生理機能的影響比較溫和，且可能觸發了光合作用相關基因的表達，提高了葉綠素、類胡蘿卜素等色素的含量，從而提升了葉片光能利用率及光合作用產物量。醇提取物對煙草幼苗生長、生理、品質等影響結果均優于水提物，因此選擇乙醇為提取溶劑進行銀杏外種皮殺蟲活性成分提取更科學有效。

土壤酶活性是反映土壤品質演變的重要生物活性指標。土壤酶主要來源于土壤中動植物和微生物活細胞的分泌物及其殘體的分解物。噴施的農藥大部分會進入土壤，從而直接影響土壤酶活性或通過影響植物根系及土壤生物組成而間接影響土壤酶活性，因此可以根據其變化趨勢及變化程度來評估農藥施用對土壤品質的影響。研究表明，化學農藥尤其是高濃度化學農藥施用會顯著改變土壤酶活性及與其密切相關的微生物群落結構。本研究顯示銀杏外種皮醇提物和水提物均未顯著改變土壤中蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶活性，這與合理濃度的百草枯等農藥未對油桐苗土壤酶活性產生劇烈影響的結果類似；結果提示銀杏外種皮提取物中的活性成分未能對土壤中可分泌上述酶蛋白的微生物種群，以及酶蛋白的空間結構產生顯著影響，Gbs提取物的施用不會對種植煙草的土壤品質產生劇烈影響。