4種微生物菌劑對為害油樟的黑絨鰓金龜死亡率、取食及代謝酶活性的影響

摘要 為探究球孢白僵菌Beauveria bassian，a SW21、布氏白僵菌B.brongniartii SW22、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis SW12及金龜子綠僵菌lVIetarhiziumanisopliae SW23對為害油樟的黑絨鰓金龜Maladera orientalis的防控效果，于菌劑處理后不同時間測定黑絨鰓金龜死亡率，取食量以及其腸道中過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及過氧化氫酶（catalase，CAT）3種保護酶、乙酰膽堿酯酶（acetylcho-linesterase，AChE）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CES）、多功能氧化酶（mixed-function oxidase，MFO）、細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）與谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase，GST）5種解毒酶和淀粉酶（amyl-ase，AMS）、胰蛋白酶（trypsin）與脂肪酶（lipase）3種消化酶活性。結果表明：4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜死亡率和取食量的影響強弱依次為布氏白僵菌gt;金龜子綠僵菌gt;球孢白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌。4種微生物菌劑可不同程度地抑制黑絨鰓金龜腸道中SOD與CAT 2種保護酶活性，促進蟲體內POD、AChE、CES、CYP450、GST、MFO、AMS、脂肪酶和胰蛋白酶活性升高。研究結果表明，4種微生物菌劑可通過持續抑制SOD與CAT的活性，降低黑絨鰓金龜清除體內活性氧自由基的能力，造成黑絨鰓金龜氧化損傷，最終增加蟲體死亡率；而黑絨鰓金龜可通過上調POD、AChE、CES、CYP450、GST、MFO、AMS、脂肪酶和胰蛋白酶的活性來維持其正常的生理功能，4種微生物菌劑在黑絨鰓金龜綠色防控方面均具有一定的潛力。

關鍵詞 黑絨鰓金龜；微生物菌劑；死亡率；保護酶；解毒酶；消化酶

中圖分類號：S 476.1 文獻標識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024144

黑絨鰓金龜Maladera orientalis （Motschulsky）是鞘翅目Coleoptera鰓金龜科Melolonthidae的一種多寄主害蟲，其食性雜，常群集暴食多種農林作物幼嫩的芽葉等組織。油樟Camphora longepaniculata為中國特有的芳香類經濟樹種，近年來由于種植規模和栽培模式的變化，導致油樟蟲害大面積發生，黑絨鰓金龜為油樟豐產栽培及產業發展的重要限制因素之一。目前，林業生產中，對黑絨鰓金龜防控多采用化學防治法，但這不僅造成土壤、水體污染，且長期的化學防治使害蟲抗藥性增強，導致蟲害防治日益困難。因此，探索穩定、高效的綠色防控技術已成為黑絨鰓金龜防治的重點工作。

“以菌治蟲”已成為林業上防治害蟲的研究熱點，該法主要是利用病原微生物使害蟲致病或抑制其繼續為害作物，具有藥效時間長、無抗藥性與安全無污染等特點。目前，應用最廣泛的病原微生物有白僵菌Beauvoeria、金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae以及蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuring-iensis等，其可通過昆蟲的表皮、消化管與氣孔等位置侵染蟲體；白僵菌通過對寄主養分的奪取及分泌毒素導致寄主死亡；綠僵菌通過釋放神經毒素，導致昆蟲的神經系統障礙，致使昆蟲死亡；蘇云金芽胞桿菌通過產生毒素致使昆蟲中毒死亡。因此在生產實踐中選擇高效菌劑進行生物防治，是保證林業生產的關鍵因素之一。

昆蟲在其生活史中，為避免天敵、農藥和環境等不利因素的影響，會產生一系列生理、生化上的變化從而提高自身的抗逆性。如昆蟲能通過合成過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superox-ide dismutase，SOD）及過氧化氫酶（catalase，CAT）等保護酶調控其細胞內活性氧的產生和清除，緩解氧化損傷；可通過合成乙酰膽堿酯酶（acetylcho-linesterase，AChE）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CES）、多功能氧化酶（mixed-function oxidase，MFO）、細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）與谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase，GST）等解毒酶來分解和代謝有害化合物，維持其正常發育和生存。此外，淀粉酶（amylase，AMS）、胰蛋白酶（trypsin）與脂肪酶（lipase）為昆蟲體內3種重要的消化酶，其活性可反映昆蟲取食消化寄主的能力，分別參與昆蟲體內的能量代謝；激活昆蟲體內其他蛋白酶原；增強昆蟲抗病性及促進信息素合成。目前，針對病原微生物對昆蟲防治的研究多集中在毒力及藥效評價等方面，而關于分析微生物菌劑對昆蟲體內代謝酶活性影響的研究較少。基于此，本研究選取球孢白僵菌Beauveria bassiana、布氏白僵菌B.brongniartii、蘇云金芽胞桿菌及金龜子綠僵菌4種微生物菌劑，通過檢測其對黑絨鰓金龜死亡率以及其腸道中代謝酶活性的影響，從而明確4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜的防控效果，以期為后續分離篩選對黑絨鰓金龜具高致病性的微生物菌株與開發微生物菌劑提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

成蟲黑絨鰓金龜于5月中旬前往宜賓市敘州區世界樟海（28°57′N，104°24′E）采集，球孢白僵菌Beatroeria basszana SW21、布氏白僵菌B.brongniartiiSW22、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis SW12及金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae SW23皆購買于鹽城市神微微生物菌種科技有限公司。

1.2方法

1.2.1微生物菌劑對黑絨鰓金龜的致死率測定

分別設置CK（蒸餾水）、球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌和金龜子綠僵菌5組處理。將球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌及金龜子綠僵菌菌粉配制成濃度為1.5×10⁹個／mL的孢子懸液，分別將2g新鮮油樟葉片放人配好的菌懸液中浸泡5s后，放入裝有50頭黑絨鰓金龜的養蟲盒中，對照（CK）組采用蒸餾水處理，重復3次。每隔48 h更換1次鮮葉，分別于0、48、96、144、192 h調查各處理試蟲存活情況，計算死亡率平均值。

剩余蟲數一該時間段開始時的總蟲數一該時間段結束時的死亡蟲數一該時間段結束時用于解剖活蟲體取其腸道的蟲體數；

死亡率=該時間段的死亡蟲數／上一時間段的剩余蟲數×100%。

1.2.2微生物菌劑處理后黑絨鰓金龜取食量測定

處理方法同上，每隔48 h統計1次各組油樟葉片被取食量，最后計算試驗期間各組黑絨鰓金龜對油樟葉片總取食量，并計算平均值。

各組油樟葉片總取食量=48 h葉片取食量+96 h葉片取食量+144 h葉片取食量+192 h葉片取食量。

1.2.3腸道取樣及黑絨鰓金龜腸道保護酶、解毒酶與消化酶活性的測定

腸道取樣及保存：分別于處理后0、48、96、144、192 h取樣，每組取4頭置于冰面上解剖并取出完整腸道，稱取0.2g腸道放入裝有1.8g pH 7.4 PBS緩沖液的研磨管中，放入組織研磨儀研磨，研磨充分后離心5min（12000r／min），取上清液置于干凈的離心管中保存于-80℃條件下用于酶活性測定。

酶活性測定：采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測黑絨鰓金龜腸道中CAT、POD、SOD、AChE、CES、CYP450、GST、IFO、AMS、Lipase與trypsin酶活性。往酶標板的微孔中預先包被待測酶抗體，設置樣品孔、標準孔和空白孔。樣品孔和標準孔分別加入樣本、標準品，再加入HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TNB顯色，TMB在HRP的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中酶活性呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）。每種酶設置6個標準品濃度，每個時間點收集的樣本設置3次生物學重復，3次技術重復。以標準品濃度作縱坐標，對應OD值作橫坐標，繪制標準品線性回歸曲線，通過標準曲線計算各樣品中酶的活性，再各組取平均值，單位為U／g。酶活性測定試劑盒皆購買于上海通蔚生物科技有限公司。

1.3數據處理

將所測的試驗數據結果利用Excel 2019統計，利用SPSS 20進行單因素方差分析，并采用Duncan氏新復極差法對不同處理間進行差異顯著性分析（Plt;0.05），最后利用Origin 2019b作圖。

2結果與分析

2.1 4種微生物菌劑處理后黑絨鰓金龜死亡率與取食量

4種微生物菌劑中，布氏白僵菌對黑絨鰓金龜的致死效果最好，在48、96、144 h及192 h時的致死率分別為11.33%、24.03%、48.43%與79.27%；其次為金龜子綠僵菌與球孢白僵菌處理，金龜子綠僵菌處理48、96、144 h及192 h時黑絨鰓金龜死亡率分別為10%、23.67%、38.23%與60.33%，球孢白僵菌處理48、96、144 h及192 h時黑絨鰓金龜死亡率分別為21.33%、17.03%、31.73%與48.87%；蘇云金芽胞桿菌處理48、96、144 h及192 h時黑絨鰓金龜死亡率分別為7.33%、12.23%、8.07%與16.03%（圖la）。

從各組黑絨鰓金龜對油樟葉片取食量來看，與CK組相比，球孢白僵菌、布氏白僵菌、金龜子綠僵菌與蘇云金芽胞桿菌4種菌劑皆顯著降低了黑絨鰓金龜對油樟葉片的取食量（Plt;0.05）；效果較優的為布氏白僵菌、金龜子綠僵菌與球孢白僵菌組，該3組中黑絨鰓金龜192 h內的總取食量分別為1.39、1.50g與1.70g，皆顯著低于CK組與蘇云金芽胞桿菌組（Plt;0.05）；蘇云金芽胞桿菌組中黑絨鰓金龜192 h內的總食用量為3.55g（圖1b）。總的來看，幾種菌劑對黑絨鰓金龜毒力和取食量的影響依次表現為卵孢白僵菌gt;綠僵菌gt;球孢白僵菌gt;蘇云金桿菌。

2.2 4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜體內保護酶活性的影響

不同微生物菌劑處理對黑絨鰓金龜腸道中的抗氧化酶產生了明顯影響。與CK組相比，不同菌劑處理抑制黑絨鰓金龜腸道中的CAT酶活性，布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌與金龜子綠僵菌3組中黑絨鰓金龜腸道中CAT酶活性基本呈現先上升后下降的趨勢；而球孢白僵菌組中黑絨鰓金龜腸道中CAT酶活性呈現持續下降的趨勢。其中球孢白僵菌、布氏白僵菌及蘇云金芽胞桿菌3組中黑絨鰓金龜腸道中CAT酶活性皆在192 h時較低，分別為241.66、422.66U／g與454.12U／g；金龜子綠僵菌組中黑絨鰓金龜腸道中的CAT酶活性在96 h時最低，為678. 76U／g；抑制效應表現為球孢白僵菌gt;布氏白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌gt;金龜子綠僵菌（圖2a）。

與CK組相比，不同菌劑處理促進黑絨鰓金龜腸道中POD活性，球孢白僵菌組中黑絨鰓金龜腸道中POD活呈現上升-下降-上升-下降的趨勢；布氏白僵菌、蘇云金桿菌與金龜子綠僵菌3組中黑絨鰓金龜腸道中POD酶活性呈現下降-上升-下降的趨勢。球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金桿菌與金龜子綠僵菌4組中黑絨鰓金龜腸道中POD活性皆在144 h時達到最高，分別為3.93、3. 50、3.11U／g與2.67U／g，促進效果表現為球孢白僵菌gt;布氏白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌gt;金龜子綠僵菌（圖2b）。

與CK組相比，4種微生物菌劑處理均抑制蟲體腸道中SOD活性，4組中黑絨鰓金龜腸道中SOD活性皆呈現下降-上升-下降的趨勢。球孢白僵菌組中黑絨鰓金龜腸道中SOD活性在48h時最低，為1070.81U／g；布氏白僵菌組中黑絨鰓金龜腸道中SOD活性在96 h時最低，為1109.07U／g；蘇云金芽胞桿菌與金龜子綠僵菌2組中黑絨鰓金龜腸道中SOD活性均在1 92 h時最低，分別為1371.27U/g與1696.16U／g，抑制效應表現為球孢白僵菌gt;布氏白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌gt;金龜子綠僵菌（圖2c）。

2.3 4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜體內解毒酶活性的影響

4種微生物菌劑處理對取食油樟的黑絨鰓金龜腸道中的解毒酶產生了明顯的影響（圖3）。與CK組相比，4種菌劑處理可刺激黑絨鰓金龜腸道解毒酶AChE（圖3a）、CES（圖3b）、CYP450（圖3c）、GST（圖3d）、MFO（圖3e）活性升高，表明這些解毒酶在其抵御菌劑侵染中發揮了重要作用。球孢白僵菌對黑絨鰓金龜腸道中解毒酶的活性變化刺激效果最大，AChE活性呈現一直上升的趨勢，在192 h時達到最高，為1948.71U／g（圖3a）; CES活性呈現上升-下降-緩慢上升的趨勢，在96h時達到最高，為8119.21U／g（圖3b）；CYP450活性呈現上升-下降-上升-下降的趨勢，在144 h時達到最高.為1298.08U／g（圖3c）；GST活性呈現先上升后下降的趨勢，在96 h時達到最高，為1360.91U／g（圖3d）；MFO活性呈現上升-下降-上升的趨勢，在192h時達到最高，為8290.26U／g（圖3e）。

在布氏白僵菌作用下，黑絨鰓金龜腸道的AChE活性呈現上升-下降-緩慢上升的趨勢，CES、CYP450活性與GST活性均呈現先上升后下降的趨勢，4種酶活性均在48h時達到最高，分別為1805.41U／g（圖3a）、7275.70U／g（圖3b）、1075.03U／g（圖3c）和1165.80U／g（圖3d）；MFO活性呈現一直上升的趨勢，在192 h時達到最高，為7211.78U/g（圖3e）。

在蘇云金芽胞桿菌的作用下，黑絨鰓金龜腸道的AChE活性呈現先下降后上升的趨勢，在192h時達到最高，為1710.52U／g（圖3a）；CES活性與MFO活性皆呈現下降-上升-下降的趨勢，其中CES活性在96h時達到最高，為6170.61U／g（圖3b）；MFO活性在144h時達到最高，為5998.37U/g（圖3e）；CYP450活性與GST活性皆呈現先上升后下降的趨勢，其中CYP450活性在144h時達到最高，為1001.27U/g（圖3c）；GST活性在144h時達到最高，為1021.80U／g（圖3d）。

在金龜子綠僵菌的作用下，黑絨鰓金龜腸道的AChE活性呈現下降-上升-下降-上升的趨勢，在192h時達到最高，為1630.52U／g（圖3a）；CES活性與IFO活性呈現先下降后上升的趨勢，其中CES活性在192 h時達到最高，為7161.02U/g（圖3b）；MFO活性在192 h時達到最高，為5655.72U/g（圖3e）；CYP450活性與GST活性皆呈現先上升后下降的趨勢，其中CYP450活性在96 h時達到最高，為870.95U／g（圖3c）；GST活性在48h時達到最高，為931.33U／g（圖3d）。綜合而言，不同菌劑處理皆可較快地刺激黑絨鰓金龜腸道解毒酶活性的升高，促進效應表現為球孢白僵菌gt;布氏白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌gt;金龜子綠僵菌。

2.4 4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜體內消化酶活性的影響

與CK組相比，4種菌劑處理能促進黑絨鰓金龜腸道中AMS（圖4a）、脂肪酶（圖4b）、胰蛋白酶（圖4c）3種消化酶的活性，這為黑絨鰓金龜獲取更多能量抵御外源脅迫。在球孢白僵菌的作用下，黑絨鰓金龜腸道的AMS活性呈現先上升后下降的趨勢，在48h時酶活性達到最高，為3786.23U／g（圖4a）；脂肪酶活性呈現一直上升的趨勢，在192h時達到最高，為9.92U／g（圖4b）；胰蛋白酶活性呈現上升-下降-上升的趨勢，在48 h時達到最高，為4400.22U／g（圖4c）。

在布氏白僵菌的作用下，黑絨鰓金龜腸道中的AMS活性呈現先上升后下降的趨勢，在144h時酶活性達到最高，為3695.12U／g（圖4a）；脂肪酶與胰蛋白酶活性皆呈現上升-下降-上升的趨勢，其中脂肪酶活性在192 h時達到最高，為8.41U／g（圖4b）；胰蛋白酶活性在96h時達到最高，為3772.17U/g（圖4c）。

在蘇云金芽胞桿菌的作用下，黑絨鰓金龜腸道中的AMS活性呈現先上升后下降的趨勢，AMS活性在144h時達到最高，為3265.11U／g（圖4a）；脂肪酶活性呈現先上升-下降-緩慢上升-下降的趨勢，在48 h時達到最高，為7.12U／g（圖4b）；胰蛋白酶活性呈現先上升后下降的趨勢，在48 h時達到最高，為3315.57U／g（圖4c）。

在金龜子綠僵菌的作用下，黑絨鰓金龜腸道中的AMS活性呈現上升－下降－上升的趨勢，在192 h時達到最高，為3502.89U／g（圖4a），脂肪酶活性呈現一直上升的趨勢，在192h時達到最高，為7.50 U／g（圖4b）；胰蛋白酶活性呈現先下降后上升的趨勢，在192h時達到最高，為3888.14U／g（圖4c）。綜合而言，不同菌劑處理皆可較快地刺激黑絨鰓金龜腸道消化酶活性的升高，促進效應表現為球孢白僵菌gt;布氏白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌gt;金龜子綠僵菌。

3討論

目前在林業上，為防治蟲害及減少林業損失，主要使用化學農藥，雖具有高效、速效且廣譜等優點，但對土壤和水體造成的毒性積聚、蟲體的耐藥以及環境中長時間殘留等缺點也日益突出。因此，亟須針對性強、對環境友好且高效的農藥。病原微生物或其次生代謝物來源于自然界，其通過影響害蟲的代謝來防控害蟲，其中白僵菌、蘇云金芽胞桿菌和綠僵菌等的研究較為深入。球孢白僵菌對黏蟲Mythimna separata、東北大黑鰓金龜Holotrichia diomphalia幼蟲及茶麗紋象甲Myllocerinus aurolineatus幼蟲等具有較高毒力。布氏白僵菌對楓楊刻蚜Kurisakia oniguru-mi的防治效果較好。蘇云金芽胞桿菌對淡色庫蚊Culex pipiens pallens幼蟲、青花菜菜青蟲、歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis等害蟲具有毒力。綠僵菌防治草地貪夜蛾Spodoptera frugi-perda幼蟲、甜菜夜蛾Spodoptera exigua與蜱蟲等的效果較好。上述研究多集中于對鞘翅目、鱗翅目等害蟲幼蟲的防治，對為害油樟的黑絨鰓金龜是否有效尚不清楚。本研究結果表明，球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌及金龜子綠僵菌對黑絨鰓金龜皆具有一定的防控效果，該研究結果與前人研究結果相似，其中，布氏白僵菌對黑絨鰓金龜的致死效果最好，抑制取食油樟葉片的效果最佳，各菌劑對黑絨鰓金龜毒力和取食量的影響強弱依次表現為布氏白僵菌gt;金龜子綠僵菌gt;球孢白僵菌gt;蘇云金芽胞桿菌。該結果可為在油樟林業生產中采用生物殺蟲劑防治黑絨鰓金龜等鞘翅目昆蟲，降低林業損失提供參考依據。

逆境脅迫及外源有毒物質能促使昆蟲體內羥氧自由基、過氧化氫以及超氧離子等活性氧自由基數量增加，對昆蟲產生毒害作用。POD、SOD與CAT等保護酶能幫助昆蟲清除其體內多余的活性氧自由基，保護機體不被外源毒物毒害。在本研究中，球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌及金龜子綠僵菌4種微生物菌劑皆不同程度地促進了黑絨鰓金龜腸道中的POD活性的升高，說明POD在黑絨鰓金龜抵抗該類病原微生物的侵染及其代謝產生的有毒物質引起的氧化脅迫中發揮了重要作用，該結果與張琛等的研究結果相似；但SOD與CAT 2種保護酶活性受到抑制，此結果與張琛等的研究結果存在差異，說明4類微生物菌劑可能是通過持續抑制SOD與CAT兩種保護酶活性，使黑絨鰓金龜清除體內活性氧自由基的能力降低，造成黑絨鰓金龜氧化損傷，最終增加其死亡率。AChE、CES與GST等解毒酶參與昆蟲對外源有毒物質的代謝及分解。在本研究中，4種微生物菌劑皆不同程度促進了黑絨鰓金龜腸道中AChE、CES、CYP450、GST與IFO 5種解毒酶活性，說明在微生物菌劑的作用下，黑絨鰓金龜可通過上調解毒酶的活性來維持其正常的生理功能，該研究結果與黃訓兵等的研究結果類似。AMS、脂肪酶與胰蛋白酶可通過促進昆蟲機體儲能物質的合成與吸收來代謝外源有害化合物。本研究中，4種微生物菌劑不同程度促進了黑絨鰓金龜腸道中AMS、脂肪酶與胰蛋白酶的活性，說明在病原微生物的侵染下，黑絨鰓金龜可通過提升體內消化酶的活性來維持其正常的生理及消化吸收功能。綜合來看，4種菌劑可破壞黑絨鰓金龜腸道中代謝酶活性的平衡。基于此，后續可從黑絨鰓金龜的生長環境中篩選白僵菌、綠僵菌、蘇云金芽胞桿菌等高致病性菌株，開發出可有效防治該害蟲的微生物菌劑。

4結論

本試驗探究了球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌及金龜子綠僵菌4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜的死亡率與食量的影響，并結合其對寄主腸道中代謝酶活性的影響，發現球孢白僵菌、布氏白僵菌、蘇云金芽胞桿菌及金龜子綠僵菌均可不同程度地提高黑絨鰓金龜的死亡率并降低其對油樟葉片的食用量；4種微生物菌劑通過抑制黑絨鰓金龜腸道中SOD與CAT 2種保護酶，降低黑絨鰓金龜清除體內活性氧自由基的能力，對黑絨鰓金龜造成氧化損傷，增加寄主死亡率；在4種微生物菌劑的作用下黑絨鰓金龜可通過上調POD、AChE、CES、CYP450、GST、MFO、AMS、脂肪酶與胰蛋白酶活性來維持其正常的生理功能。4種微生物菌劑對黑絨鰓金龜皆具有不同程度的毒力，能破壞寄主腸道中代謝酶的平衡，該研究結果可為后續開發針對性防治黑絨鰓金龜的微生物菌劑提供參考依據。對于微生物菌劑混用是否對黑絨鰓金龜的致死率及取食量具有更大的影響，本試驗尚未涉及，相關研究將在后續試驗中進行。