Wolbachia感染下松毛蟲赤眼蜂Atg8基因表達(dá)特征

摘要 細(xì)胞內(nèi)共生菌Wolbachia可誘導(dǎo)卵寄生蜂赤眼蜂發(fā)生孤雌產(chǎn)雌生殖現(xiàn)象。細(xì)胞自噬是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)和抵御病原物的重要機(jī)制，是影響Wolbachia感染和增殖的重要因子。其中，ATG8／LC-3蛋白是細(xì)胞自噬的重要指示蛋白。本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂Trichogramma dendrolimi細(xì)胞自噬關(guān)鍵基因TdeAtg8，該基因編碼的TdeATG8蛋白包含130個氨基酸，具有ATG8蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量為15.25kD，理論等電點(diǎn)為9.432。檢測不同發(fā)育階段松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系和未感染品系的TdeAtg8轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，與未感染品系相比，感染品系的TdeAtg8轉(zhuǎn)錄水平在蛹期和成蟲期顯著上調(diào)，在預(yù)蛹期顯著下調(diào)；兩種品系的TdeAtg8轉(zhuǎn)錄水平在卵期和幼蟲期無顯著差異。研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示W(wǎng)olbachia與宿主細(xì)胞自噬反應(yīng)的相互作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 Wolbachia；細(xì)胞自噬；松毛蟲赤眼蜂；生物防治；Atg8

中圖分類號：S 476.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024210

細(xì)胞內(nèi)共生菌Wolbachia廣泛存在于節(jié)肢動物中，在調(diào)節(jié)宿主繁殖方面扮演著重要角色。Wol-bachia通過宿主生殖細(xì)胞進(jìn)行母系傳播，可引起宿主細(xì)胞質(zhì)不親和、雌性化、孤雌生殖和雄性死亡等生殖表型。其中，Wolbachia可以誘導(dǎo)卵寄生蜂赤眼蜂Trichogramma孤雌產(chǎn)雌生殖。孤雌產(chǎn)雌生殖的雌蜂無需交配就能產(chǎn)下具有控害功能的雌性子代，因此Wolbachia介導(dǎo)的孤雌產(chǎn)雌生殖赤眼蜂在生物防治中具有較高應(yīng)用潛力。

細(xì)胞自噬通過溶酶體主動降解異常蛋白、受損細(xì)胞器和病原體，是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。細(xì)菌、病毒等病原體侵染細(xì)胞時，病原體可誘導(dǎo)細(xì)胞形成杯狀隔膜包繞在被降解物周圍，隨后逐漸延伸至降解物周圍形成封閉的自噬體膜。自噬體經(jīng)細(xì)胞骨架運(yùn)輸至溶酶體，通過自噬溶酶體主動降解內(nèi)部成分。自噬體形成機(jī)制在不同生物中具有高度保守性。在細(xì)胞自噬過程中，自噬相關(guān)蛋白前體ATG8首先經(jīng)過ATG4蛋白酶的切割暴露C端甘氨酸（Gly）殘基，經(jīng)ATG7（E1酶）激活轉(zhuǎn)移至ATG3 （E2酶），通過ATG12-ATG5-ATG16 （E3酶）大分子復(fù)合物與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl etha-nolamine，PE）結(jié)合形成ATG8-PE復(fù)合物。ATG8-PE復(fù)合體定位于自噬體膜上，自噬體成熟后其外膜上的ATG8被ATG4解偶聯(lián)。隨后，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，將自噬體內(nèi)膜偶聯(lián)的ATG8及內(nèi)部包含的折疊錯誤的蛋白質(zhì)、入侵微生物、多余或損傷的細(xì)胞器一同降解。在上述過程中，ATG8蛋白是參與整個自噬過程的重要標(biāo)志蛋白，也是自噬體膜形成的重要標(biāo)志。

Wolbachia是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)共生菌，其對細(xì)胞的感染和自身增殖活動依賴于宿主細(xì)胞的生理活動。宿主細(xì)胞則可通過細(xì)胞自噬活動調(diào)節(jié)Wolba-chia對宿主細(xì)胞的感染，是宿主調(diào)節(jié)Wolbachia在不同組織細(xì)胞感染水平的重要機(jī)制。例如，在黑腹果蠅Drosophila melanogaster中，果蠅體細(xì)胞的Wolbachia受細(xì)胞自噬的負(fù)調(diào)節(jié)，其細(xì)胞自噬反應(yīng)使Wolbachia感染滴度隨胚胎的發(fā)育而下降。透射電鏡發(fā)現(xiàn)果蠅體內(nèi)Wolbachia可與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬現(xiàn)象。在果蠅和線蟲體細(xì)胞組織中，Wolbachia的共生株系或致病株系皆受到宿主細(xì)胞自噬調(diào)控，快速復(fù)制的Wol-bachia可激活宿主的自噬反應(yīng)。這些現(xiàn)象表明，自噬是宿主調(diào)節(jié)Wolbachia感染滴度的重要機(jī)制。

本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白（TdeATG8）基因（TdeAtg8），采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）檢測松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系和未感染品系在不同發(fā)育階段的Atg8轉(zhuǎn)錄水平。研究旨在明確細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白TdeATG8在松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系和未感染品系的表達(dá)規(guī)律，初步明確Wolbachia感染對赤眼蜂細(xì)胞自噬水平的影響。研究結(jié)果將為進(jìn)一步探究Wolbachia與赤眼蜂細(xì)胞自噬反應(yīng)的相互作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

供試松毛蟲赤眼蜂Wolbachia感染品系（Tdw）和未感染品系（Td）采集自遼寧省桓仁滿族自治縣（41°10′N，125°25′E）。松毛蟲赤眼蜂種群以柞蠶Antheraea Pernyi卵為中間寄主繁育，在溫度（25±1）℃、相對濕度（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8h條件下連代飼養(yǎng)。

1.2松毛蟲赤眼蜂細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白基因TdeAtg8的克隆

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

取松毛蟲赤眼蜂寄生后發(fā)育20 min（卵期）、3d（幼蟲期）、6d（預(yù)蛹期）、9d（蛹期）的柞蠶卵，解剖獲得柞蠶卵內(nèi)的子代蜂。成蟲期樣本取自初羽化24h內(nèi)的子代蜂。采用Trizol法提取Tdw和Td各發(fā)育階段的總RNA，以核酸蛋白儀驗證RNA濃度和純度。提取的RNA采用定量PCR專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eras-er，Perfect Real Time，TaKaRa，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]反轉(zhuǎn)錄cDNA，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2TdeAtg8的cDNA全長擴(kuò)增與測序

參照NCBI中已登錄的膜翅目Hymenoptera模式昆蟲Atg8同源序列，查詢對應(yīng)氨基酸序列，通過TBtool-x64的Blast比對篩選出松毛蟲赤眼蜂轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)錄本所編碼的同源蛋白序列及CDS區(qū)序列。采用在線網(wǎng)站（https：∥www.primer3plus.com）設(shè)計Atg8基因全長序列上、下游擴(kuò)增引物（上游引物：

5′-AT GAATCTCGTACCAAAATCTTTC-3′；下游引物：5′-TTAAGAACTCTCACAGAGCTTG-3′）。以前期獲得的cDNA為模板，使用高保真酶預(yù)混液[PrimeSTA Max Premix（2×），TaKaRa，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]擴(kuò)增Atg8全長序列。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1μL，高保真酶預(yù)混液25μL，上、下游引物（10μmol／各1μL，ddH₂O21μL。PCR反應(yīng)程序為98℃ 3 min; 98℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 mm。擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4℃。利用膠回收試劑盒（Omega GelExtraction Kit，Omega，廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司）將PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)pEASY-T1 simple（北京全式金生物技術(shù)有限公司）表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒后測序。

1.3TdeATG8的生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站NovoPro （https：∥www. novopro.cn／tools／translate.html）對TdeATG8進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽預(yù)測和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。利用在線網(wǎng)站NCBI分析TdeATG8的保守結(jié)構(gòu)域。從NCBI（https：∥www. ncbi.nlm.nih.gov／）分別下載不同昆蟲的ATG8氨基酸同源序列[煙蚜繭蜂Aphidius gifuensis（XP 044007066.1），Diachasrma alloeum （XP 015112600.1），毀側(cè)溝繭蜂Microplitis demolitor（XP 008553788.1），中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis me-diator （XP 057320069.1），菜粉蝶盤絨繭蜂Cotesia glomerata （XP 044589810.1），島甲腹繭蜂Chelo-nus insularis （XP 034935317.1），葉舌蜂Hylaeus volcanicus （XP 053973286.1），紅腹尾蜂Orussus abietinus （XP 012280792.1），紅石蜂Osrnia bzcor-nis （XP 029032143.1），火紅熊蜂Bombus pyrosoma（XP 043592571.1），小蜜蜂Apis florea（XP 003691334.1），多胚跳小蜂Copidosoma florida-num （XP 014206291.1），短管赤眼蜂Trichogram-ma pretiosum （XP 014223823.1），麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis（XP 031782411.1）]。通過DNAMAN對松毛蟲赤眼蜂及其他膜翅目昆蟲的ATG8進(jìn)行氨基酸序列比對。采用MEGA11軟件的鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建ATG8同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap=1000）。

1.4TdeAtg8在Td和Tdw不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平定量分析

選擇RPL10（上游引物：5 '-TCCGCGCACA-CATCTATACA-3';下游引物：5 '-TTGACTGT-GCCACTGAAACG-3'）和RPS13（上游引物：5'-TCCCAGTCAGCTTTGCCATA-3';下游引物：5'-GCACTTGAGCAACACCATGA-3'）[生工生物工程（上海）有限公司合成]作為RT-qPCR反應(yīng)內(nèi)參基因。選取前期獲得的Tdw和Td不同發(fā)育階段子代蜂cDNA。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每一生物學(xué)重復(fù)設(shè)3次機(jī)械重復(fù)。利用RT-qPCR檢測各品系不同發(fā)育階段TdeAtg8轉(zhuǎn)錄水平（上游引物：5 '-GCATCCCACGCAAGCATTTT-3'；下游引物：5'-ACAGAGCTTGTGTGTTGATCCA-3'）。RT-qPCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1.6μL（200ng／μL），上、下游引物（10μmol／L）各0.8μL，2×TBGreen Premix Ex TaqⅡ[TaKaRa，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]10μL，ddHO 6.8μL，反應(yīng)程序為：95℃30 s；95℃5s，51℃30 s，39個循環(huán)；72℃30 s，95℃ 10 s，以0.5℃／s從60℃升溫至95℃維持5s。利用2^-△△C_T法計算TdeAtg8的相對表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1 TdeAtg8的序列特征

TdeAtg8序列全長570 bp，編碼130個氨基酸，無跨膜區(qū)，無信號肽，蛋白質(zhì)分子量為15.25 kD，等電點(diǎn)為9.432。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測TdeATG8主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在N端第16-120位氨基酸殘基之間有1個UbLATG8_1VIAPILC3保守結(jié)構(gòu)域。TdeATG8氨基酸序列具有ATG4和ATG7互作位點(diǎn)。N端第49-53位氨基酸殘基之間具有保守的ATG13互作區(qū)域（圖1）。TdeATG8的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（alpha helix）占38.46%，β-折疊（betastrand）占6.92%，無規(guī)則卷曲（random coil）占40.77%，延長鏈（extended strand）占13.85%。

TdeATG8與同為膜翅目赤眼蜂科赤眼蜂屬的短管赤眼蜂的同源蛋白氨基酸序列相似性最高，為99.23%。該分支又與多胚跳小蜂聚為一支（圖2）。

2.2 Tdw和Td不同發(fā)育階段TdeAtg8的轉(zhuǎn)錄水平

與Td相比，Tdw預(yù)蛹期TdeAtg8的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)（df=77，t=3.555，P=0.006），蛹期（df=77，t=18.381，Plt;0.001）和成蟲期（df=77，t=21.926，Plt;0.001）顯著上調(diào)，在卵期（df=77，t=1.693，P=0.095）和幼蟲期（df=77，t=0.732，P=0.466）均無顯著差異。Td成蟲期TdeAtg8轉(zhuǎn)錄水平顯著高于除卵期外的其他時期。Tdw成蟲期TdeAtg8轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他時期；幼蟲期最低（圖3）。

3結(jié)論與討論

本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂的TdeAtg8全長cDNA，預(yù)測編碼的TdeATG8含有1個UbLATG8 MAPILC3保守結(jié)構(gòu)域。TdeATG8的Ubl與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合是自噬體形成的重要過程。

ATG8不僅在自噬體膜的延伸中發(fā)揮作用，還會通過銜接的ATG13蛋白將聚集的蛋白、線粒體、和病原物招募到自噬體膜上。TdeATG8 N端第49-53位氨基酸殘基是調(diào)節(jié)LC3蛋白與ATG13LIR結(jié)構(gòu)域相互作用的重要區(qū)域。TdeATG8在進(jìn)化上較為保守，與短管赤眼蜂的ATG8同源蛋白在演化上具有相似性。

Wolbachia感染顯著上調(diào)了松毛蟲赤眼蜂蛹期及成蟲期的自噬水平。自噬是細(xì)胞控制Wolbachia感染和增殖的重要機(jī)制。果蠅Atg16、Atg13缺失突變體Wolbachia感染滴度相對于野生型顯著上升，暗示自噬是控制細(xì)胞內(nèi)Wolbachia增殖的主要因素。Wolbachia在果蠅幼期均勻分布，但隨著子代的發(fā)育，頭部等組織的Wolbachia感染滴度顯著下降，呈現(xiàn)出限制性感染模式，果蠅體內(nèi)Wolba-chia的限制性感染模式與細(xì)胞自噬相關(guān)。本研究組前期研究也發(fā)現(xiàn)，赤眼蜂Wolbachia相對滴度在蛹期和成蟲期逐漸呈現(xiàn)下降趨勢。據(jù)此推測Wolbachia感染介導(dǎo)的松毛蟲赤眼蜂預(yù)蛹期及蛹期的細(xì)胞自噬活動可能參與了塑造赤眼蜂成蟲的Wolbachia感染滴度和分布格局。Hargitai等發(fā)現(xiàn)，Wolbachia感染介導(dǎo)的宿主自噬反應(yīng)可能與Wolbachia自身的損傷有關(guān)。果蠅體內(nèi)Wolbachia感染區(qū)域限制于卵巢等特定器官，伴隨宿主發(fā)育，在感染及增殖過程中受損傷的Wolbachia數(shù)量逐漸積累，從而激活宿主細(xì)胞自噬反應(yīng)清除部分Wolba-chia。使用抗生素處理果蠅后，宿主體內(nèi)受損及死亡Wolbachia顯著增加，自噬強(qiáng)度顯著上調(diào)。

本研究發(fā)現(xiàn)，2種品系的松毛蟲赤眼蜂在卵期、蛹期和成蟲期的細(xì)胞自噬標(biāo)志基因Atg8轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于幼蟲期和預(yù)蛹期。不同發(fā)育階段子代蜂細(xì)胞分化和組織發(fā)育的特點(diǎn)可能致使相應(yīng)時期細(xì)胞自噬水平存在差異，使細(xì)胞自噬關(guān)鍵基因Atg8在不同發(fā)育階段差異顯著。在鱗翅目等昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程中，蛻皮激素可參與誘發(fā)細(xì)胞自噬引起的Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡，用以代謝或降解幼蟲的組織細(xì)胞。在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中，中腸和絲腺的細(xì)胞自噬分子相應(yīng)與其體內(nèi)蛻皮酮激素滴度高度同步。赤眼蜂屬于典型的全變態(tài)昆蟲，細(xì)胞自噬對其維持不同階段變態(tài)發(fā)育的穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞自我更新、參與執(zhí)行細(xì)胞增殖和分化等過程至關(guān)重要。在這一過程中，細(xì)胞通過自噬作用將細(xì)胞組分重新代謝利用，促進(jìn)器官或組織的形成。赤眼蜂在蛹期會逐步形成各種內(nèi)部器官，赤眼蜂化蛹后，新的體壁會在預(yù)蛹體壁下形成，經(jīng)10h發(fā)育后，體軀開始分節(jié)，足芽、翅芽和觸角芽開始形成并逐漸延長。在子代蜂體軀內(nèi)部，神經(jīng)系統(tǒng)開始出現(xiàn)，腦芽發(fā)育形成腦和腦神經(jīng)，腹索神經(jīng)變粗并形成神經(jīng)節(jié)。子代蜂預(yù)蛹中的生殖囊也逐漸發(fā)育為生殖腺。上述現(xiàn)象揭示細(xì)胞自噬水平在蛹期開始上調(diào)可能與赤眼蜂的變態(tài)發(fā)育過程有關(guān)。在成蟲期，赤眼蜂卵巢中的卵母細(xì)胞仍會繼續(xù)發(fā)育成熟，同時成蟲遭遇營養(yǎng)缺乏等環(huán)境脅迫時，也會通過細(xì)胞自噬保障其生存。例如，當(dāng)環(huán)境營養(yǎng)缺乏時，某些昆蟲會通過自噬促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用。赤眼蜂胚胎在卵裂后，會逐步分化形成胚盤，同時胚胎開始出現(xiàn)細(xì)胞分化形成胚層，伴隨漿膜、羊膜、胚帶、口節(jié)、體壁的形成，胚體開始分節(jié)并出現(xiàn)附器。在這些過程中，細(xì)胞自噬都有參與并發(fā)揮了重要作用。

Wolbachia作為細(xì)胞內(nèi)共生菌與受感染的節(jié)肢動物存在著互惠、共生、寄生關(guān)系，在昆蟲生物學(xué)領(lǐng)域有著重要地位。但它與松毛蟲赤眼蜂自噬反應(yīng)的相互作用機(jī)制還未知。本研究為進(jìn)一步揭示W(wǎng)olbachia與宿主細(xì)胞自噬反應(yīng)的相互作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。