皂角豆象幼蟲齡期指標(biāo)與判別

摘要 明確皂角豆象Megabruchidius dorsalis幼蟲發(fā)育狀況和最佳分齡指標(biāo)，有助于為其預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及種群防控提供理論依據(jù)。通過室內(nèi)飼養(yǎng)，逐日測(cè)量幼蟲的頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)和體寬等形態(tài)指標(biāo)，并運(yùn)用頻次分布、多峰擬合、核密度估計(jì)法、Dyar法則判斷皂角豆象幼蟲的齡數(shù)，運(yùn)用Crosby生長(zhǎng)法則和回歸分析進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：皂角豆象幼蟲頭殼寬和上顎寬多峰擬合和核密度估計(jì)分析顯示出4個(gè)明顯的正態(tài)峰；僅頭殼寬的Crosby指數(shù)小于0.1且Brooks指數(shù)較為穩(wěn)定，說明幼蟲的頭殼寬度可作為劃分齡期的形態(tài)指標(biāo)，其1～4齡幼蟲的頭殼寬平均值分別為0.166、0.311、0.530、0.834 mm。室內(nèi)28℃下飼養(yǎng)幼蟲歷期約為16d，根據(jù)幼蟲頭殼寬和日齡的關(guān)系，1～4齡幼蟲的日齡分別介于1～6、3～9、5～11 d和8～16 d之間。因此，皂角豆象幼蟲可分為4齡，頭殼寬作為其幼蟲分齡最佳指標(biāo)。

關(guān)鍵詞

皂角豆象；幼蟲齡期；頭殼寬；多峰擬合；核密度估計(jì)法；Crosby指數(shù)

中圖分類號(hào)：S 763. 38 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024126

皂角豆象Megabruchidius dorsalis （Fahraeus，1839），又名皂莢豆象，隸屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae豆象亞科Bruchinae，原隸屬錐胸豆象屬Bruchidius Schilsky，后Borowiee根據(jù)其觸角無(wú)雌雄二型和雌蟲臀板上的凹陷，以其為模式種建立了Megabruchidius屬。該蟲常以高齡幼蟲和成蟲越冬，主要分布在印度、日本、歐洲和中國(guó)等地，在我國(guó)主要分布在各皂角種植區(qū)，已知寄主大多為皂莢屬Gleditsia Linn.植物。皂角豆象主要以幼蟲鉆蛀莢果為害，其成蟲通常在皂莢和皂角種子表面產(chǎn)卵，幼蟲孵化后鉆入種子中直到羽化后鉆出，一年發(fā)生多代，且連續(xù)為害，幼蟲易隨著莢果擴(kuò)散，因此，幼蟲期是該蟲的主要防治階段。在各皂角種植區(qū)，大量皂角的種子遭到皂角豆象的蛀害，其中，在貴州莢果受害率可達(dá)73%，該害蟲嚴(yán)重降低皂角的產(chǎn)量和質(zhì)量。

皂角豆象幼蟲鉆蛀取食皂角莢果，隱蔽性強(qiáng)，由于皂角莢果十分堅(jiān)硬，難以通過蛻皮直接觀察其幼蟲齡數(shù)。目前，僅李猷等報(bào)道了該蟲的生物學(xué)特性，但其將幼蟲期和蛹期籠統(tǒng)地稱為豆內(nèi)期，未能詳細(xì)劃分其齡數(shù)和測(cè)定齡期。明確皂角豆象幼蟲的齡數(shù)和齡期，可為該蟲的科學(xué)研究、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和種群生態(tài)防治提供重要依據(jù)。目前，確定幼蟲齡期的方法很多，最常用的方法為目測(cè)直方圖的頻率分布分析圖，核密度估計(jì)法以及基于K-均值或高斯混合模型的聚類分析。通過以上方法獲得的齡數(shù)可依據(jù)Crosby生長(zhǎng)法則與回歸分析評(píng)估其是否合理。根據(jù)Dyar法則，相鄰齡期的昆蟲頭殼寬度存在著一定的幾何級(jí)數(shù)關(guān)系，據(jù)此可以推斷幼蟲的齡數(shù)。崔小林等通過測(cè)量分析幼蟲頭殼寬、上顎寬和體長(zhǎng)將綠豆象Callosobruchus chinensis Linnaeus幼蟲分為4個(gè)齡期；通過觸角孔間距和前胸背板寬度可將檸條綠虎天牛Chlorophorus caragana Xie amp; Wang幼蟲階段分為7個(gè)齡期。目前，對(duì)于皂角豆象幼蟲齡期僅在Lezhenina等的研究中發(fā)現(xiàn)有4齡幼蟲，但并未詳細(xì)報(bào)道劃分依據(jù)。

因此，本文通過逐日測(cè)量皂角豆象幼蟲的頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)和體寬，并運(yùn)用頻次分布和核密度估計(jì)法分別推測(cè)幼蟲齡數(shù)，運(yùn)用Crosby生長(zhǎng)法則和回歸分析方法判斷皂角豆象幼蟲的最佳分齡方法及其指標(biāo)并驗(yàn)證幼蟲的齡數(shù)，為皂角豆象幼蟲齡期的準(zhǔn)確劃分提供依據(jù)，為明確皂角豆象預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及種群生態(tài)防控提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試蟲源

供試蟲源采自于2020年10月采自貴州織金縣（106°03′E-106°04′E，26°32′N-26°33′N）周邊皂角莢中，連同莢果一起帶回實(shí)驗(yàn)室在人工氣候箱（RX2-380A-LED，寧波江南儀器廠）恒定條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為（28±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光周期L∥D=10 h∥14 h。在塑料盒（225 mm×155mm×80 mm）中放置皂角Gleditsia sinensis Lam.種子飼養(yǎng)，建立實(shí)驗(yàn)種群，連續(xù)飼養(yǎng)多代，塑料盒頂部蓋紗布透氣。成蟲羽化后，根據(jù)臀板上的凹陷等特征，區(qū)分皂角豆象成蟲性別，并每天用新鮮黃瓜片補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，備用。

1.2幼蟲樣本收集

在飼養(yǎng)條件下，將新羽化的皂角豆象（♀：♂=1：1）配對(duì)后放人培養(yǎng)皿（35mm）中飼養(yǎng)并觀察產(chǎn)卵情況，待卵孵化后，用毛筆刷將初孵幼蟲挑至皂角種子上，觀察幼蟲鉆人種子。每天隨機(jī)選取15粒皂角種子，沿皂角種子的種臍走向剖開取出幼蟲，將蟲體展平，逐頭測(cè)量相關(guān)形態(tài)指標(biāo)，其余有蟲種子繼續(xù)飼養(yǎng)，直到所取幼蟲化蛹，累計(jì)取16d，共解剖240粒有蟲種子（240個(gè)樣本）。

1.3分齡指標(biāo)及測(cè)量方法

參考崔小林等的研究選取皂角豆象幼蟲的頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)及體寬作為其分齡指標(biāo)。將收集到的幼蟲平展，使用奧斯微視頻顯微鏡（AO-FD600E，深圳市奧斯微光學(xué)儀器有限公司）測(cè)量幼蟲的頭殼寬-Y1（與蟲體縱軸垂直的頭殼最寬處），上顎寬-Y2（與蟲體縱軸垂直的上顎最寬處），體長(zhǎng)-Y3（頭部最前端沿中軸縱向至腹部最末端）和體寬-Y4（與蟲體縱軸垂直的最寬處）（圖1）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 26.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行頻次分析，在假設(shè)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)分布呈正態(tài)分布情況下，使用以下2種方法分析數(shù)據(jù)。

多峰擬合法與指數(shù)回歸分析：用Origin 2018（Origin Lab）作每項(xiàng)指標(biāo)相應(yīng)的頻次分布直方圖，然后進(jìn)行多峰擬合，根據(jù)曲線單峰數(shù)量、擬合效果、Dyar法則等判斷幼蟲齡數(shù)，將相鄰兩峰正態(tài)曲線的交點(diǎn)作為蟲齡分界點(diǎn)。多峰擬合高斯函數(shù)如式（1）：

式中，Y₀代表函數(shù)垂直偏移量，A代表振幅，W代表關(guān)聯(lián)高斯函數(shù)寬度的參數(shù)，x_C代表函數(shù)峰值對(duì)應(yīng)的x值。

齡數(shù)確定后，根據(jù)測(cè)量值計(jì)算指標(biāo)（頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)、體寬）的樣本數(shù)、變幅、均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差及變異系數(shù)。對(duì)皂角豆象幼蟲齡期（x）與其對(duì)應(yīng)指標(biāo)測(cè)量值進(jìn)行指數(shù)回歸分析，其他必要計(jì)算均在Microsoft Excel 2021中進(jìn)行。

核密度估計(jì)法與指數(shù)回歸分析：通過應(yīng)用R語(yǔ)言的“ggplot2”包中的“geom_density\"函數(shù)獲取核密度曲線，目測(cè)0.05～0.12 mm范圍內(nèi)的不同帶寬所得曲線。其中，帶寬為核密度估計(jì)的關(guān)鍵參數(shù)，決定核密度函數(shù)平滑程度。帶寬過窄，核密度函數(shù)波動(dòng)劇烈，包含大量噪聲帶寬過寬，核密度函數(shù)過度平滑，造成數(shù)據(jù)細(xì)節(jié)丟失。選擇最佳帶寬構(gòu)建的核密度曲線的最低點(diǎn)作為各齡期的分離點(diǎn)，確定齡期后再進(jìn)行與第一種方法類似的處理。

結(jié)合Crosby生長(zhǎng)法則和指數(shù)回歸分析，評(píng)價(jià)齡期劃分的合理性。當(dāng)Crosby指數(shù)小于0.1且R²愈高時(shí)，劃分齡期的分組愈合理，反之則不合理。Brooks指數(shù)、Crosby指數(shù)、變異系數(shù)計(jì)算公式：

2結(jié)果與分析

2.1皂角豆象幼蟲指標(biāo)的多峰擬合法與指數(shù)回歸分析

對(duì)240頭皂角豆象各齡幼蟲樣本的頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)和體寬4項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)的測(cè)量值進(jìn)行頻次分布和多峰擬合。通過頭殼寬（圖2a）和上顎寬（圖2b）的頻次分布直方圖可以觀察到4個(gè)明顯的集中分布區(qū)域（一個(gè)集中區(qū)域代表一個(gè)齡期），無(wú)明顯重疊現(xiàn)象，多峰擬合也顯示具有4個(gè)明顯的正態(tài)峰（頭殼寬：R²=0.936；上顎寬：R²=0.948；Plt;0.05）（表1），則初步判定頭殼寬和上顎寬可作為皂角豆象幼蟲分齡指標(biāo)。皂角豆象幼蟲體長(zhǎng)和體寬頻次分布圖未見明顯集中分布區(qū)（圖2c，d），無(wú)法判別幼蟲齡期。根據(jù)Dyar法則可以初步判定皂角豆象幼蟲的齡數(shù)為4齡。正態(tài)曲線交點(diǎn)作為蟲齡分界點(diǎn)，1～4齡幼蟲的頭殼寬平均值分別為0.166、0.311、0.530、0.834mm，上顎寬平均值分別為0.073、0.173、0.306、0.446 mm（表2）.

分別以頭殼寬與上顎寬為依據(jù)所對(duì)應(yīng)1～4齡幼蟲其體長(zhǎng)、體寬范圍值一致。其中體長(zhǎng)平均值分別為0.685、0.920、1.553、4.040 mm，體寬平均值分別為0.286、0.543、0.998、2.404 mm（表2）。各齡期測(cè)量數(shù)值間重疊現(xiàn)象嚴(yán)重。

對(duì)皂角豆象幼蟲齡期（z）與其對(duì)應(yīng)的頭殼寬（圖3a）、上顎寬（圖3b）、體長(zhǎng)（圖3c）和體寬（圖3d）的測(cè)量值進(jìn)行指數(shù)回歸分析。結(jié)果表明，頭殼寬和上顎寬的指數(shù)關(guān)系與齡期存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，其中頭殼寬與齡期之間的指數(shù)擬合模型的回歸系數(shù)最大（R²=0.9753）。

2.2皂角豆象幼蟲指標(biāo)的核密度估計(jì)與指數(shù)回歸分析

在頭殼寬（圖4a）、上顎寬（圖4b）、體長(zhǎng)（圖4c）、體寬（圖4d）的核密度估計(jì)圖中都可以觀察到4個(gè)明顯的集中分布區(qū)域（1個(gè)集中區(qū)域代表1個(gè)齡期），再將不連續(xù)點(diǎn)確定為每個(gè)連續(xù)齡期之間的分離點(diǎn)，可以初步判定皂角豆象幼蟲齡數(shù)為4齡，其中1～4齡幼蟲的頭殼寬平均值分別為0.166、0.313、0.537、0.834mm，上顎寬平均值分別為0.074、0.174、0.306、0.446 mm，體長(zhǎng)平均值分別為0.839、1.997、3.828、5.456 mm，體寬的平均值分別為0.466、1.323、2.388、3.072mm（表2）.

對(duì)皂角豆象幼蟲齡期（x）與其對(duì)應(yīng)的頭殼寬（a）、上顎寬（b）、體長(zhǎng)（c）和體寬（d）的測(cè)量值進(jìn)行指數(shù)回歸分析（圖5）。結(jié)果表明，頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)的指數(shù)關(guān)系與齡期存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，頭殼寬與齡期之間的指數(shù)擬合模型的回歸系數(shù)最大（R²=0.9749）。

2.3皂角豆象幼蟲Crosby指數(shù)分析

結(jié)果表明，在皂角豆象幼蟲齡期的2種分離方法（多峰擬合法與核密度估計(jì)法）中頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)和體寬4項(xiàng)指標(biāo)都可區(qū)分為4個(gè)齡期。進(jìn)一步分析2種方法中皂角豆象幼蟲各齡指標(biāo)的測(cè)量值的樣本數(shù)、變幅、平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差、變異系數(shù)、Brooks指數(shù)和Crosby指數(shù)（表2）。

在多峰擬合法和核密度估計(jì)法中，僅皂角豆象幼蟲頭殼寬Crosby指數(shù)小于0.1且Brooks指數(shù)較為穩(wěn)定，表明2種擬合方法以頭殼寬為分齡指標(biāo)將皂角豆象幼蟲劃分為4個(gè)齡期合理。

2.4皂角豆象幼蟲各齡齡期

根據(jù)Crosby生長(zhǎng)法則和回歸分析法驗(yàn)證幼蟲的齡數(shù)為4齡，試驗(yàn)過程中觀察到1～4齡幼蟲如圖6所示。皂角豆象幼蟲從第12天開始陸續(xù)停止取食，16d后全部停止。連續(xù)16d每日隨機(jī)抽取15頭幼蟲測(cè)量其頭殼寬，可得頭殼寬與幼蟲日齡的關(guān)系，1～4齡幼蟲的日齡分別介于1～6、3～9、5～11d和8～16d之間，相鄰齡期有重疊現(xiàn)象，第3天、第5天和第8天幼蟲開始跨齡（圖7）。

3結(jié)論與討論

明確幼蟲的齡數(shù)和齡期，可為昆蟲生物學(xué)特性研究提供基礎(chǔ)，也是確定幼蟲防治時(shí)機(jī)的重要依據(jù)。準(zhǔn)確判別幼蟲齡期需要依據(jù)幼蟲蛻皮作為標(biāo)準(zhǔn)，但皂角豆象幼蟲難以通過蛻皮直接觀察齡數(shù)變化，因此可以使用Dyar法則確定皂角豆象幼蟲齡期。本研究基于皂角豆象幼蟲頭殼寬、上顎寬、體長(zhǎng)和體寬的測(cè)量值的頻次分布，利用多峰擬合、核密度估計(jì)法、Dyar法則與回歸分析推測(cè)皂角豆象幼蟲齡期為4齡。2種方法中皂角豆象幼蟲頭殼寬的R²均優(yōu)于其他形態(tài)指標(biāo)的R²，且僅頭殼寬Crosby指數(shù)小于0.1，說明在皂角豆象幼蟲分齡中頭殼寬為最佳分齡形態(tài)指標(biāo)。多峰擬合法中頭殼寬R²值較核密度估計(jì)法中的高，即多峰擬合法比核密度估計(jì)法更為適合對(duì)皂角豆象幼蟲進(jìn)行分齡。結(jié)合室內(nèi)飼養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)皂角豆象幼蟲頭殼寬和上顎寬與幼蟲日齡的關(guān)系，可推測(cè)1～6d為1齡幼蟲，2齡和3齡幼蟲齡期交叉明顯，2齡幼蟲介于3～9d，3齡幼蟲介于5～11d，4齡幼蟲介于8～16d之間。

在許多蛀干害蟲的分齡研究中，不同種類最佳分齡指標(biāo)存在一定差異，其中頭殼和上顎作為骨化程度較高的結(jié)構(gòu)，常被作為最合理可靠的分齡指標(biāo)，如在鞘翅目松褐天牛Monochamus alternatus Hope、赤斑白條天牛Batocera rufomaculata Degeer、蜂巢奇露尾甲Aethina tumida Murray幼蟲的分齡研究中，發(fā)現(xiàn)幼蟲頭殼寬被作為分齡指標(biāo)；上顎長(zhǎng)作為星天牛Anoplophora chinensis Forste分齡指標(biāo)優(yōu)于其他指標(biāo)；在鉆蛀性害蟲鱗翅目昆蟲幼蟲的分齡研究中，梨小食心蟲Grapholitha molesta Bus-ck、甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hubner、菱角水螟Parapoynx crzsonalis Walker等幼蟲皆可通過頭殼寬準(zhǔn)確劃分齡數(shù)。當(dāng)然，其他指標(biāo)如尾又及其長(zhǎng)度、前胸背板、單眼和觸角間距等也可用于幼蟲分齡，諸如尾又及其長(zhǎng)度是白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis Fairmaire分齡的理想指標(biāo)；前胸背板寬度可作為松褐天牛M.alternatus Hope幼蟲齡期劃分的指標(biāo)；陸俊姣等研究了華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita Faldermann幼蟲的齡數(shù)，發(fā)現(xiàn)其單眼間距和觸角間距易觀察測(cè)量，且Crosby指數(shù)均小于0.1，以及與齡期的回歸擬合較好（Plt;0.001），并且明確了各齡歷期（在25℃下可分為3個(gè)齡期，分別為22、30、180 d），因此，不同昆蟲的分齡指標(biāo)需進(jìn)行驗(yàn)證方可判斷其有效性。本研究中發(fā)現(xiàn)幼蟲頭殼寬為最佳的分齡指標(biāo)，這與桑天牛Apriona germari Hope幼蟲、油茶象Curculio chinensis幼蟲分齡的研究結(jié)果一致。

本研究中皂角豆象體長(zhǎng)和體寬容易受食物狀況、測(cè)量過程的影響，重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，因此不推薦為蟲齡劃分的指標(biāo)，這與其他研究結(jié)果一致。因?yàn)樵谙嗤g期下的幼蟲，受個(gè)體發(fā)育或其他因素的影響，體長(zhǎng)和體寬可能差異較大，如處于饑餓狀態(tài)下的楊黑點(diǎn)葉蜂Pristophora conjugata的幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，但實(shí)際生產(chǎn)中由于體長(zhǎng)和體寬易于用肉眼觀察，可以作為輔助分齡指標(biāo)。

溫度、濕度、光照、幼蟲密度、成蟲性信息素、寄主植物等因素亦會(huì)影響幼蟲發(fā)育，從而影響幼蟲的齡數(shù)。崔小林等研究了不同溫度下綠豆象幼蟲的齡期劃分，根據(jù)對(duì)綠豆象幼蟲的體長(zhǎng)、頭殼寬及上顎寬測(cè)量值進(jìn)行頻次分布和曲線擬合，推斷20、25、30℃條件下綠豆象幼蟲分別為5齡、4齡和3齡。因此特定條件下齡期的準(zhǔn)確劃分，對(duì)于昆蟲生物學(xué)習(xí)性和綠色防控至關(guān)重要。有關(guān)不同溫度、濕度、光照和寄主植物等對(duì)皂角豆象幼蟲齡數(shù)和齡期的影響程度還需進(jìn)一步探索。