浙江平湖地區(qū)二化螟田間種群對(duì)6種殺蟲劑的抗性監(jiān)測(cè)

摘要 為明確平湖地區(qū)二化螟Chilo suppressalis田間種群的抗性水平及抗性機(jī)制，連續(xù)2年測(cè)定了6個(gè)二化螟種群對(duì)6種殺蟲劑的抗性，并測(cè)定了上述種群的主要解毒酶羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶（GSTs）及多功能氧化酶（P450）活性。結(jié)果表明，平湖地區(qū)二化螟種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺、四唑蟲酰胺、阿維菌素、多殺霉素、甲氧蟲酰肼產(chǎn)生了中高等水平抗性。相同年份比較，3個(gè)不同田間種群對(duì)同一藥劑的抗性水平差別不大；不同年份比較，抗藥性變化情況隨藥劑不同而變化。二化螟種群對(duì)不同藥劑抗藥性與解毒酶活性的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，氯蟲苯甲酰胺、四唑蟲酰胺、阿維菌素、多殺霉素4種藥劑的抗性與P450酶活性具有顯著相關(guān)性。由此可見，平湖地區(qū)6個(gè)二化螟種群對(duì)所監(jiān)測(cè)的6種常用藥劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，且大部分藥劑抗性的產(chǎn)生機(jī)制與P450酶活性相關(guān)。

關(guān)鍵詞 二化螟；殺蟲劑；抗性監(jiān)測(cè)；生物測(cè)定；解毒酶

中圖分類號(hào)：S 481.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024255

水稻的穩(wěn)定供應(yīng)是保證我國(guó)糧食安全的關(guān)鍵。然而水稻的整個(gè)生長(zhǎng)季均易遭受蟲害威脅，其中二化螟Chilo suppressalis發(fā)生嚴(yán)重。二化螟屬于鱗翅目Lepidoptera草螟科Crambidae，具有超強(qiáng)的繁殖力及越冬能力，在東南亞及我國(guó)長(zhǎng)江以南水稻產(chǎn)區(qū)皆有分布。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)二化螟年發(fā)生面積為2.2億hm²，造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)115億元。二化螟主要通過(guò)鉆蛀方式取食為害，在苗期可造成水稻枯鞘、枯心和蟲傷株，在孕穗期和穗期可造成枯孕穗和白穗等。盡管水稻植株本身對(duì)二化螟為害有一定的補(bǔ)償機(jī)制，但在孕穗期、抽穗揚(yáng)花期等重要時(shí)期二化螟大發(fā)生，仍能造成50%～60%的白穗率，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%以上，致使水稻減產(chǎn)50%甚至100%，嚴(yán)重威脅我國(guó)水稻的安全生產(chǎn)。近年來(lái)，隨著國(guó)家糧食政策導(dǎo)向、種植結(jié)構(gòu)和耕作制度的調(diào)整以及機(jī)械化程度的提高，二化螟的為害有加劇的趨勢(shì)。

長(zhǎng)期以來(lái)，施用化學(xué)殺蟲劑都是防治二化螟的主要措施。早期，二化螟的防治首選殺蟲雙（單）等沙蠶毒素類殺蟲劑。20世紀(jì)90年代后，主要稻區(qū)大面積推廣應(yīng)用三唑磷、毒死蜱和阿維菌素等有機(jī)磷類和大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑。2008年以后，雙酰胺類殺蟲劑如氯蟲苯甲酰胺、四唑蟲酰胺等在水稻上開始大面積推廣使用。目前水稻二化螟的化學(xué)防治以施用雙酰胺類及阿維菌素、多殺霉素等為主，甲氧蟲酰肼也常用于跟其他藥劑混配來(lái)防治二化螟。然而，長(zhǎng)期不合理的使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致二化螟對(duì)多種類型的藥劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，防治效果下降。喹硫磷、毒死蜱等有機(jī)磷類殺蟲劑的使用歷史較長(zhǎng)，二化螟對(duì)該類藥早已產(chǎn)生抗性。氯蟲苯甲酰胺已經(jīng)使用近10年，我國(guó)部分地區(qū)水稻二化螟在2017年就對(duì)其產(chǎn)生了不同水平的抗性，其中在浙江溫嶺地區(qū)抗性超過(guò)200倍，達(dá)到高抗水平。任宗杰等報(bào)道，2021年浙江東部沿海地區(qū)二化螟種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺處于高水平抗性（抗性倍數(shù)152～1293倍）。近幾年，浙江省二化螟對(duì)阿維菌素的抗藥性也逐年上升，目前已達(dá)中低抗水平。

平湖市地處浙江杭嘉湖平原，全市以種植單季晚稻為主，常年播種面積約1.5萬(wàn)hm²。21世紀(jì)初，平湖市二化螟發(fā)生較輕，但近年來(lái)隨著品種布局、氣候條件、耕作制度的不斷演變，特別是雜交稻種植面積的擴(kuò)大，二化螟種群數(shù)量逐年增長(zhǎng)。為明確平湖地區(qū)二化螟的抗藥性現(xiàn)狀，本研究連續(xù)兩年監(jiān)測(cè)了平湖地區(qū)3個(gè)主要水稻種植鄉(xiāng)鎮(zhèn)的二化螟種群對(duì)6種化學(xué)殺蟲劑的抗性水平，分析了平湖地區(qū)二化螟抗藥性與主要解毒酶之間的關(guān)系，為平湖地區(qū)二化螟的抗藥性治理提供理論支撐。

1材料與方法

1.1二化螟田間種群采集

6個(gè)二化螟越冬種群分別于2022年和2023年3月—4月采自平湖地區(qū)的當(dāng)湖（121.01°E，30.70°N）、新埭（121.08°E，30.82°N）、乍浦（121.10°E，30.60°N）3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)。越冬幼蟲或蛹置于溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期L∥D=16h∥8h的人工氣候室飼養(yǎng)，待其羽化出成蟲產(chǎn)卵，卵孵化后的Fi代3齡幼蟲用于抗性水平檢測(cè)及酶活性測(cè)定，幼蟲飼養(yǎng)方法采用人工飼料法。

1.2供試藥劑

選用6種殺蟲劑原藥，包括：阿維菌素（98%，河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司），多殺霉素（99%，陜西惠誠(chéng)生物科技有限公司），茚蟲威（99%，陜西惠誠(chéng)生物科技有限公司），氯蟲苯甲酰胺（95%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司），四唑蟲酰胺（99%，江蘇恒益信生物科技有限公司），甲氧蟲酰肼（98.2%，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)高希武教授提供）。

1.3毒力測(cè)定

采用稻莖浸漬法進(jìn)行毒力測(cè)定。每種藥劑先用丙酮或者二甲基亞砜（氯蟲苯甲酰胺）配制成1000mg／L的儲(chǔ)存液，然后用含0.1%的TritonX-100溶液等比稀釋5個(gè)不同濃度梯度（表1）。將分蘗期的水稻剪成5～6 cm的莖段，放人預(yù)先配制的藥液中浸漬10s后自然陰干。將晾干后的莖段放人事先準(zhǔn)備好的底部鋪有4層保濕濾紙的塑料瓶中（體積200mL），每瓶用毛筆接入10頭二化螟3齡幼蟲，每組重復(fù)3次，以0.1%的Triton X-100溶液作為對(duì)照。72 h后統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡情況，用毛筆輕輕觸碰不動(dòng)的記為死亡。

1.4解毒酶活性測(cè)定

CarE活性測(cè)定：參照Lu等的方法。每個(gè)樣品選取5頭大小一致的二化螟3齡幼蟲，加入pH7.0的磷酸緩沖液（PBS）1 mL，充分勻漿后，在4℃，12000 g條件下離心15 min，取上清液40μL作為酶液加入酶標(biāo)板中，加入100μL底物與顯色劑的混合液（含0.2mol／L、pH 6.0的PBS，10 mmolα-乙酸萘酯和1mmol固藍(lán)RR鹽）。加入5μL酶液和45μL PBS，利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi)OD₄₅₀變化，以反應(yīng)速度表示酶活力[nmol／（min.mg）]，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

GST活性測(cè)定：參照Habig等的方法。用0.1mol／L，pH 6.5的PBS制備酶液，在96孔酶標(biāo)板中依次加入45μL PBS、5μL上清液（即酶液，制備方法同CarE）、50μL 1.2 mmol／L的1-氯-2，4-二硝基苯（ CDNB）和50μL 6 mmol／L的還原型谷胱甘肽（GSH）。測(cè)定10 min內(nèi)OD₃₄₀變化，以反應(yīng)速度表示酶活力[nmol／（min.mg）]，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

細(xì)胞色素P450酶活性測(cè)定：參考Rose等的方法。利用0.1mol／L、pH 7.6的PBS（含DTT、EDTA、苯基硫、PMSF，濃度均為1 mmol／L）制備酶液。在96孔酶標(biāo)板中依次加入2μmol／L對(duì)硝基苯甲醚（溶解于0.1mol／L pH 7.6的PBS） 50μL，9.6 mmol／L的NADPH 5μL和45μL酶液。測(cè)定10 min內(nèi)OD405變化，以反應(yīng)速度表示酶活力[nmol／（min.mg）]，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5蛋白含量測(cè)定

利用Bradford的考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定酶提取液的蛋白含量。

1.6數(shù)據(jù)處理

利用PoloPlus軟件（Probit and Logit Analy-sis，Le-Ora Software，LeOra軟件公司）對(duì)毒力測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算斜率、卡方值（X²）、LC₅₀及95%置信區(qū)間等數(shù)據(jù)；利用測(cè)定種群的LC₅₀/敏感基線（敏感種群LC₅₀）計(jì)算抗性倍數(shù)；抗性級(jí)別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（NY／T 2058-2014）建立的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：低水平抗性（5.0100.0）；根據(jù)LC₅₀ 95%的置信區(qū)間是否有重疊判斷種群抗性水平是否有顯著差異。酶活性數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用ANOVA和Tukey’s算法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較。利用SPSS 17.0軟件的Pearson方法對(duì)LC₅₀值和酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1平湖地區(qū)二化螟的抗藥性水平

2.1.1二化螟對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性水平

由表2可以看出，2022年，氯蟲苯甲酰胺對(duì)二化螟的LC₅₀由高到低依次為當(dāng)湖、乍浦和新埭；2023年，LC₅₀由高到低依次為當(dāng)湖、新埭和乍浦；與2022年的測(cè)定結(jié)果相比，2023年對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性倍數(shù)有所提高，除當(dāng)湖種群外，其他2個(gè)種群抗性水平顯著提高（LC₅₀的95%置信區(qū)間無(wú)重疊）；6個(gè)種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺抗性均達(dá)到高抗水平。

2.1.2二化螟對(duì)四唑蟲酰胺的抗性水平

由表3可以看出，2022年和2023年間，四唑蟲酰胺對(duì)二化螟的LC⁵⁰由高到低依次為乍浦、當(dāng)湖和新埭；與2022年相比，2023年對(duì)四唑蟲酰胺的抗性均顯著提高（LC⁵⁰的95%置信區(qū)間無(wú)重疊）；除2023年的當(dāng)湖和乍浦種群對(duì)四唑蟲酰胺抗性達(dá)到高水平抗性外，其他監(jiān)測(cè)種群均為中等水平抗性。

2.1.3二化螟對(duì)阿維菌素的抗性水平

由表4可以看出，2022年和2023年間，阿維菌素對(duì)二化螟的LC⁵⁰由高到低依次為新埭、乍浦和當(dāng)湖；與2022年相比，2023年對(duì)阿維菌素的抗性倍數(shù)均有所提高，除當(dāng)湖種群外，其他2個(gè)種群抗性顯著提高（LC⁵⁰的95%置信區(qū)間無(wú)重疊）；6個(gè)種群對(duì)阿維菌素抗性均達(dá)到中等水平。

2.1.4二化螟對(duì)多殺霉素的抗性水平

由表5可以看出，2022年，多殺霉素對(duì)二化螟種群的LC⁵⁰由高到低依次為新埭、乍浦和當(dāng)湖；2023年，LC⁵⁰由高到低依次為乍浦、當(dāng)湖和新埭；與2022年相比，2023年對(duì)多殺霉素的抗性倍數(shù)均有所提高，其中當(dāng)湖和新埭種群抗性顯著提高（LC⁵⁰的95%置信區(qū)間無(wú)重疊）；6個(gè)種群對(duì)多殺霉素抗性均達(dá)到中等水平。

2.1.5二化螟對(duì)甲氧蟲酰肼的抗性水平

由表6可以看出，2022年和2023年間，甲氧蟲酰肼對(duì)二化螟的LC⁵⁰由高到低依次為當(dāng)湖、乍浦和新埭；與2022年相比，2023年對(duì)甲氧蟲酰肼的抗性倍數(shù)均有所提高，無(wú)顯著差異（LC⁵⁰的95%置信區(qū)間重疊）；6個(gè)種群對(duì)甲氧蟲酰肼的抗性均達(dá)到高抗水平。

2.1.6二化螟對(duì)茚蟲威的抗性水平

由表7可以看出，2022年和2023年間，茚蟲威對(duì)二化螟的LC⁵⁰由高到低依次為新埭、當(dāng)湖、乍浦；與2022年相比，2023年對(duì)茚蟲威的抗性倍數(shù)變化不明顯；6個(gè)種群對(duì)茚蟲威的抗性均為低抗水平。

2.2二化螟的解毒酶活性

解毒酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，連續(xù)2年采集的平湖市不同地理種群二化螟體內(nèi)CarE、GSTs、P450單加氧酶活性均無(wú)顯著差異（表8）。

2.3平湖地區(qū)二化螟種群對(duì)不同藥劑的抗性與酶活性之間的相關(guān)性分析

抗性與酶活性之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，平湖市二化螟種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺、四唑蟲酰胺、阿維菌素、多殺霉素4種藥劑的抗性與P450酶活性具有顯著相關(guān)性（Plt;0.05，表9）；對(duì)這6種藥劑的抗性與CarE、GST活性無(wú)顯著的相關(guān)性（Plt;0.05，表9）。

3結(jié)論與討論

氯蟲苯甲酰胺和四唑蟲酰胺均屬于雙酰胺類殺蟲劑，作用于害蟲的魚尼丁受體，使其過(guò)度釋放細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中的鈣離子，最終導(dǎo)致昆蟲癱瘓死亡。二者的區(qū)別在于四唑蟲酰胺屬于新型雙酰胺類殺蟲劑，持效期約25d，而氯蟲苯甲酰胺持效期約15d左右。任宗杰等報(bào)道，2021年浙江二化螟種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生了高水平抗性（抗性倍數(shù)152～1293倍）。本研究結(jié)果顯示，處于浙江北部杭嘉湖平原的平湖市二化螟種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性倍數(shù)在135～257倍間，全部處于高水平抗性，這與任宗杰等報(bào)道結(jié)果接近。而對(duì)四唑蟲酰胺的抗性倍數(shù)在56～110之間，顯著低于氯蟲苯甲酰胺，與氯蟲苯甲酰胺相比，四唑蟲酰胺是更為高效的雙酰胺類藥劑。同樣，大量抗性監(jiān)測(cè)報(bào)道顯示浙江大部分稻區(qū)二化螟對(duì)雙酰胺類藥劑都產(chǎn)生了較高水平的抗性。阿維菌素和多殺霉素同屬于大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑。任宗杰等報(bào)道，浙江東部沿海地區(qū)二化螟種群對(duì)阿維菌素產(chǎn)生了中等至高水平抗性（抗性倍數(shù)11～173倍）。本研究結(jié)果顯示，平湖市二化螟種群對(duì)阿維菌素和多殺霉素的抗性倍數(shù)分別在47～95、29～56之間，處于中等水平抗性，這與任宗杰等報(bào)道的結(jié)果類似，與Lu等的抗性監(jiān)測(cè)相比，抗性倍數(shù)有所提高，但并不明顯。甲氧蟲酰肼是第二代雙酰肼類昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，為蛻皮激素激動(dòng)劑。2019年的抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，浙江東部沿海地區(qū)的二化螟種群對(duì)甲氧蟲酰肼已達(dá)到高水平抗性（RR=118.2～649.4），占監(jiān)測(cè)種群的27.3%；江西、安徽、湖北、四川、江蘇等地區(qū)二化螟種群對(duì)甲氧蟲酰肼則表現(xiàn)為敏感至中等水平抗性（RR=4.9～95.5），占監(jiān)測(cè)種群的72.7%。本研究表明，平湖地區(qū)二化螟種群對(duì)甲氧蟲酰肼的抗性已全部達(dá)到高抗水平，與以往的監(jiān)測(cè)結(jié)果相比，抗藥性呈明顯上升趨勢(shì)。這可能與甲氧蟲酰肼常與其他種類藥劑混配用于水稻螟蟲的田間防控密切相關(guān)。茚蟲威是一種廣譜噁二嗪類殺蟲劑，可通過(guò)阻斷昆蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈉離子通道，使神經(jīng)細(xì)胞失去功能。茚蟲威單劑用于防治二化螟并不常見，因此，關(guān)于二化螟對(duì)茚蟲威抗性監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)報(bào)道較少，但常與其他藥劑混配使用。衛(wèi)勤等報(bào)道25%茚蟲威·甲氧蟲酰肼懸浮劑防治水稻二化螟具有效果好、持效期長(zhǎng)、對(duì)水稻生長(zhǎng)安全等優(yōu)點(diǎn)。鑒于抗藥性產(chǎn)生發(fā)展規(guī)律，我們應(yīng)該密切關(guān)注二化螟對(duì)茚蟲威的抗性變化情況。

從本研究監(jiān)測(cè)結(jié)果看，浙江省平湖地區(qū)6個(gè)二化螟種群對(duì)所監(jiān)測(cè)的6種常用藥劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，且氯蟲苯甲酰胺、四唑蟲酰胺、阿維菌素、多殺霉素4種藥劑的抗性與解毒酶P450酶活性具有顯著相關(guān)性。建議平湖地區(qū)二化螟的防治采用中低水平抗性的藥劑輪換使用，例如四唑蟲酰胺、阿維菌素、多殺霉素、茚蟲威；暫停使用氯蟲苯甲酰胺。此外，應(yīng)注意與綠色防控措施相結(jié)合，比如利用誘集植物香根草、釋放赤眼蜂等生態(tài)調(diào)控措施，降低農(nóng)藥的使用量。