酵母單雜與亞細(xì)胞定位技術(shù)在水稻抗病基因啟動子互作蛋白篩選中的應(yīng)用進(jìn)展

中圖分類號：S-03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-6737（2025）03-0031-05

Abstract：Asanimportantglobalfoodcrop，diseasemanagementofriceisof greatsignificance forensuringfoodsecurity. Theresearchaims toreview theapplication progressofyeastone hybridandsubcelularlocalization techniquesin screningpromoterinteractingproteinsofricediseaseresistancegenes，andexplorethepotentialofthesetechniquesin improvingricediseaseresistance.Byanalyzing theapplicationcasesof these technologies，guidancewillbe provided for futureresearchdirections，andnewstrategiesandmethodswillbeprovidedforricediseaseresistancebreding.The resultsindicatethatyeastonehybridtechnologyhashighsensivityandsimpleoperationinidentifyingspecificbinding proteinsof specificDNA sequences，whilesubcelular localizationtechnologyprovidesan important perspectivefor understanding protein function and its role in signal transduction pathways.

KeyWords：Rice;Disease-resistant genes；Golden iron lock；Yeast singlecompound;Subcelularlocalization

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，水稻作為全球重要的糧食作物之一，其病害管理尤為關(guān)鍵。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對水稻抗病基因的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法轉(zhuǎn)向了分子層面的深入探索。其中，酵母單雜交系統(tǒng)和亞細(xì)胞定位技術(shù)的應(yīng)用，為水稻抗病基因啟動子互作蛋白的篩選提供了強有力的工具。酵母單雜交系統(tǒng)是一種在酵母細(xì)胞內(nèi)分析與鑒定轉(zhuǎn)錄因子與DNA順式作用元件相互結(jié)合的有效方法[1-2]。該系統(tǒng)基于真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域的功能獨立性，通過構(gòu)建含有特定順式作用元件的誘餌DNA和轉(zhuǎn)錄因子融合的獵物蛋白，來鑒定和驗證轉(zhuǎn)錄因子-基因調(diào)控序列的相互作用關(guān)系[3。這一技術(shù)的應(yīng)用，不僅能夠識別與特定DNA序列特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，還能篩選和鑒定蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，從而構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。亞細(xì)胞定位技術(shù)則能夠確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的具體位置，這對于理解蛋白質(zhì)的功能和它們在信號傳導(dǎo)途徑中的作用至關(guān)重要。

特別是在水稻抗病基因的研究中，通過亞細(xì)胞定位技術(shù)可以揭示抗病相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能區(qū)域，進(jìn)而推斷其在抗病過程中的作用機制。酵母單雜交系統(tǒng)因其操作簡單、靈敏度高、能夠直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列等優(yōu)點，在植物基因工程研究中的應(yīng)用日益廣泛。酵母單雜交與亞細(xì)胞定位技術(shù)在水稻抗病基因啟動子互作蛋白篩選中的應(yīng)用，不僅加深了對水稻抗病機制的理解，也為抗病基因的克隆和利用提供了新的策略和方法。研究將綜述這些技術(shù)在水稻抗病基因研究中的應(yīng)用進(jìn)展，探討它們在提高水稻抗病性方面的應(yīng)用進(jìn)展。

1水稻抗病基因研究進(jìn)展

水稻稻瘟病是影響水稻產(chǎn)量最主要的病害之一，稻瘟病在水稻的各個生育期都可發(fā)生，根據(jù)發(fā)生時期和部位不同，可以分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟和谷粒瘟等。病斑具有明顯的褐色邊緣，中央灰白色，在潮濕條件下，病部會產(chǎn)生灰綠色的霉?fàn)钗?。侯金祥等人對早燦稻稻瘟病抗性基因進(jìn)行了鑒定，在104份早稻稻瘟病抗性基因鑒定中發(fā)現(xiàn)Pigm基因分布最廣，攜帶Pigm的品系最多，但感病頻率存在。Pi2、Pikh和Pita基因的品系均表現(xiàn)抗病，具有育種應(yīng)用潛力。李小曼成功克隆了杜仲EuCHIT73.88基因，并在煙草和水稻中驗證了其抗病性。該基因在煙草和水稻保護(hù)性酶活性提高，病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)量上調(diào)，表現(xiàn)出增強的抗病性，創(chuàng)制出了新的抗病水稻種質(zhì)。水稻張世璽的研究團(tuán)隊通過雜交和回交方法，成功聚合了抗稻瘟病基因Pia和抗白葉枯病基因 Xa23 ，創(chuàng)制了70份穩(wěn)定的水稻恢復(fù)系。這些恢復(fù)系及其雜交組合在田間表現(xiàn)中抗性均達(dá)到中抗及以上水平，有效提升了水稻對兩種主要病害的抗性。于雅潔等人發(fā)現(xiàn)抗性基因Pib在江蘇太湖地區(qū)粳稻中分布頻率最高，Pita次之，Pi2最低。Pita、Pib及Pi2的熒光掃描結(jié)果如圖1所示[]。圖1中，多數(shù)材料攜帶2個抗性基因，尤其是 Pita+Pib 組合較為常見。田間抗病性鑒定表明，材料中存在復(fù)合基因型時，中抗級別以上材料占比顯著高于單一基因型，表明抗性基因共存可增強對稻瘟病的抗性。

水稻作為主要糧食產(chǎn)物，其抗病性研究關(guān)乎世界人民的“飯碗”。迄今為止，已鑒定出100多個稻瘟病主效抗性基因和30多個部分抗性基因。其中28個主效抗性基因如Pi2、Pita、Pib等已被成功克隆，為抗病育種提供了分子標(biāo)記輔助選擇?？共』蛟诓煌酒贩N中分布不均，如Pi2、Pita、Pib等基因在某些地區(qū)可能存在較高的分布頻率[1-12]抗病基因的聚合可以提高水稻對稻瘟病的抗性，如Pi2、Pita、Pib的聚合可以增強水稻對稻瘟病的抗性?？共』虻淖饔脵C制涉及模式識別受體和抗性蛋白。抗病基因通過編碼NBS-LRR類蛋白，增強水稻的抗病性。通過雜交和分子標(biāo)記輔助選擇，提高水稻的抗病性[13-14。利用基因聚合技術(shù)，提高水稻對多種病害的抗性。未來的研究更加注重水稻抗病基因的分子機制。

2酵母單雜及亞細(xì)胞定位技術(shù)在啟動子互作蛋白篩選中的應(yīng)用

2.1亞細(xì)胞定位技術(shù)在基因表達(dá)分析中的應(yīng)用亞細(xì)胞定位技術(shù)是一系列用于確定蛋白質(zhì)或

RNA在細(xì)胞內(nèi)特定位置的方法。這些技術(shù)包括免疫熒光顯微鏡、電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)等。它們通過標(biāo)記目標(biāo)分子，利用熒光染料、抗體或生物素等探針，結(jié)合顯微成像技術(shù)，揭示生物大分子在細(xì)胞中的分布[5。蘇浩天等人成功克隆草地早熟禾PpMYB2基因，并發(fā)現(xiàn)其在根中表達(dá)量最高，響應(yīng)GA和ABA激素，以及干旱和高鹽脅迫。亞細(xì)胞定位分析顯示 PpMYB2 定位于細(xì)胞核，表明其作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。溫海洋的研究團(tuán)隊克隆了煙草NtWRKY11基因，發(fā)現(xiàn)其編碼332個氨基酸，與苧麻BnWRKY11相似性達(dá)54.23% 。亞細(xì)胞定位技術(shù)揭示NtWRKY11蛋白定位于細(xì)胞核，表明其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能。亞細(xì)胞定位技術(shù)的原理主要依賴于熒光蛋白的特性。通過將目標(biāo)蛋白與熒光蛋白融合，可以在激光共聚焦顯微鏡的作用下觀察到自標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，如圖2所示。

亞細(xì)胞定位技術(shù)在植物啟動子及轉(zhuǎn)錄因子的分析中較為常見。江舟等人研究了金鐵鎖中WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因PtWRKY1和PtWRKY2的克隆及分析。通過生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)這兩個轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白質(zhì)為分泌蛋白，且亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。它們都含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，與藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性[8。山草梅的研究團(tuán)隊克隆并分析了水稻抗?jié)摳€蟲基因OsRAI1。生物信息學(xué)分析顯示，OsRAI1編碼一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，具有親水性，無跨膜結(jié)構(gòu)域，非跨膜蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，OsRAI1蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號一致，暗示其在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用[]。Kwak等人對水稻OsS1Fa1的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。

結(jié)果顯示，OsS1Fa1定位于細(xì)胞核膜和細(xì)胞質(zhì)膜，如圖3所示。圖3中，突變和細(xì)胞組分分析表明，膜定位結(jié)構(gòu)域決定了OsS1Fa1的亞細(xì)胞定位。水稻同源物OsS1Fa2和擬南芥直系同源物AtS1Fa1、AtS1Fa2和AtS1Fa3也表現(xiàn)出 與OsS1Fa1相似的定位模式2%]。

圖3中可以看到，利用亞細(xì)胞定位技術(shù)，可直接確定目標(biāo)基因相關(guān)表達(dá)物質(zhì)在相關(guān)細(xì)胞中的位置，從而分析相關(guān)蛋白的表達(dá)及作用機制。亞細(xì)胞定位技術(shù)還可以根據(jù)基因功能，分析不同基因的表達(dá)路徑與作用機制。Wang等人通過亞細(xì)胞定位技術(shù)揭示了水稻中蔗糖運輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)控因子。發(fā)現(xiàn)SEM1蛋白在質(zhì)膜中定位，對蔗糖從源葉到韌皮部的運輸至關(guān)重要。SEM1的功能喪失導(dǎo)致蔗糖運輸受阻，影響光合作用和淀粉積累。Rattanawong等人利用亞細(xì)胞定位技術(shù)探究了水稻中活性氧的動態(tài)變化、谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)以及谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)和定位，發(fā)現(xiàn)受精后水稻卵細(xì)胞內(nèi)ROS水平高，隨后逐漸下降，GPX1和3的表達(dá)上調(diào)22。亞細(xì)胞定位技術(shù)能夠幫助科研人員確定特定基因編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的精確位置，還可以與基因表達(dá)分析相結(jié)合，以研究特定基因在不同組織、發(fā)育時期、環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式。除此之外，還可以用于分析特定基因啟動子的誘導(dǎo)響應(yīng)性，這對于開發(fā)新型化學(xué)誘導(dǎo)啟動子具有重要意義[23]。

2.2酵母單雜交系統(tǒng)在啟動子互作蛋白篩選中的應(yīng)用

酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)基于真核生物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能特點，尤其是轉(zhuǎn)錄因子GAL4的兩個互不干擾的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。圖4為酵母單雜交系統(tǒng)，其中，用特異的DNA序列取代了DNA-Gal4結(jié)合位點，省略了酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體。將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（minimal promoter， Pmin ）上游，把報告基因連接到 Pmin 下游。編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞，如轉(zhuǎn)錄因子能夠和順式作用元件結(jié)合，就能激活 Pmin 啟動子，使報告基因得到表達(dá)。

酵母單雜交系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于驗證DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，尋找與目的DNA片段相互作用的蛋白質(zhì)分子，由此找到了許多新的轉(zhuǎn)錄因子。胡國豪等人通過酵母單雜交系統(tǒng)篩選與CcCas5啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建了含有CcCas5基因 2600bp 啟動子序列的酵母單雜交啟動子誘餌載體，并確定了3-氨基 ^{-1，2，4-} 三唑的最佳抑制濃度。為進(jìn)一步篩選與CcCas5啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和研究轉(zhuǎn)錄因子對CcCas5表達(dá)的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)[24]。陳一恒等人克隆了葡萄VvCCD1b基因及其啟動子序列，利用酵母單雜交技術(shù)，篩選出與VvCCD1b啟動子互作的轉(zhuǎn)錄因子，包括VvRAP2-4和VvWRKY4，為揭示葡萄類胡蘿卜素代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，其互作蛋白的篩選結(jié)果如圖5所示[25]。

圖5中可以看到， VvCCD16 啟動子的初步篩選結(jié)果較好，可直接確定與 VvCCD16 啟動子相關(guān)的互作蛋白。利用酵母單雜交系統(tǒng)進(jìn)行啟動子互作蛋白的篩選時，需要建立cDNA文庫。梁浩掩人跟構(gòu)建了人參根系酵母單雜交和雙雜交cDNA文庫，利用Gateway技術(shù)和DSN均一化技術(shù)。通過酵母單雜交篩選與人參 PgD14 基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，以及酵母雙雜交篩選與 Pgpht2-1 蛋白互作的蛋白2。馬曉玲研究了乙烯對油茶種仁中 α- 亞麻酸（ALA）積累的影響，重點探討了關(guān)鍵基因CoFAD7的表達(dá)調(diào)控機制。通過克隆CoFAD7啟動子并構(gòu)建乙烯誘導(dǎo)的油茶酵母單雜交cDNA文庫，利用酵母單雜交技術(shù)篩選與CoFAD7啟動子結(jié)合的上游調(diào)控因子，其cDNA文庫的構(gòu)建過程如圖6所示27。

圖6中可以看到，在構(gòu)建酵母單雜交cDNA文庫時，需要先對目標(biāo)基因進(jìn)行篩選鑒定，隨后將其導(dǎo)入酵母中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)外源蛋白與誘餌DNA成功結(jié)合時，會激活報告基因的表達(dá)，從而通過表型變化來識別互作蛋白。

3 討論與結(jié)論

酵母單雜交和亞細(xì)胞定位技術(shù)在基因啟動子互作蛋白篩選中的應(yīng)用，已顯著推進(jìn)了對水稻抗病基因功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。通過這些技術(shù)，研究者能夠精確鑒定與特定啟動子序列相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而揭示水稻抗病基因的調(diào)控機制。酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展顯示，該技術(shù)在鑒定特定DNA序列結(jié)合蛋白方面具有高靈敏度和操作簡單的特點。通過構(gòu)建含有特定順式作用元件的誘餌DNA和轉(zhuǎn)錄因子融合的獵物蛋白，研究者能夠識別與特定DNA序列特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，并篩選和鑒定蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。這不僅有助于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，也為抗病基因的克隆和利用提供了新的策略和方法。亞細(xì)胞定位技術(shù)的應(yīng)用則為理解蛋白質(zhì)功能和信號傳導(dǎo)途徑中的作用提供了重要視角。通過確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的具體位置，可分析相關(guān)蛋白表達(dá)及其轉(zhuǎn)移通路，以此可進(jìn)一步分析相關(guān)抗病基因的抗病作用機制。此外，亞細(xì)胞定位技術(shù)還能通過定位相關(guān)蛋白表達(dá)位置，揭示抗病相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能區(qū)域。未來，可進(jìn)一步優(yōu)化酵母單雜交和亞細(xì)胞定位技術(shù)，提高篩選的準(zhǔn)確性和效率。同時，探索將這兩種技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)整合的可能性，以實現(xiàn)更全面的基因功能分析。利用互作蛋白篩選結(jié)果，構(gòu)建更為全面的水稻抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示不同抗病基因間的協(xié)同作用和調(diào)控機制。

參考文獻(xiàn)：

[1]張媛，黃芳，馬燕林，等.與酵母單雜交系統(tǒng)匹配的植物瞬時表達(dá)分析載體的構(gòu)建[J].分子植物育種，2021，19（8）：2616-2620.

[2]余婧，楊慧，余世洲，等.煙草NtCBT基因啟動子酵母單雜誘餌載體構(gòu)建及互作蛋白篩選[J].生物技術(shù)通報，2022.38（10）：73-79.

[3]于敬文，周向平，于清，等.植物轉(zhuǎn)錄因子在線蟲與寄主互作中的功能研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)，2024，50（6）：20-30.

[4]李心，武敬也，陳菲兒，等.MsWRKY33轉(zhuǎn)錄調(diào)控MsACS2影響紫花苜蓿耐鹽性的研究[J].草地學(xué)報，2024，32（1）：54-65.

[5]樂林芝，馬濤，代禹美，等.結(jié)核分枝桿菌致病相關(guān)蛋白 Rv2387 的生物信息學(xué)分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2024，40（11）：983-989.

[6]LIWei，ZHANGMengchen，YANGYaolong，etal.MolecularEvolution of RiceBlast Resistance Gene bsr-d1 [J].RiceScience，2024，31（6）： 700-711.

[7]侯金祥，趙超越，胡繼杰，等.早粘稻稻瘟病抗性基因鑒定及抗性評價[J].雜交水稻，2024，39（6）：18-28.

[8]李小曼.杜仲EuCHIT73.88基因克隆及其在水稻抗病種質(zhì)創(chuàng)制中的應(yīng)用[D].貴州：貴州大學(xué)，2024.

[9]張世璽，姚堅，楊海龍，等.聚合抗稻瘟病基因Pia和抗白葉枯病基因 Xa23 的廣親和恢復(fù)系選育[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（11）：111-115.

[10] 于雅潔，曹鵬輝，宋云生，等.江蘇太湖地區(qū)粳稻稻瘟病抗性基因（Pi2、Pita、Pib）的分布及抗病效應(yīng)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2024，40（5）：769-776.

[11] 黃宣，邱海萍，嚴(yán)成其，等.聚合抗稻瘟病基因 Pigm 和抗白葉枯病基因 Xa23 改良粳稻寧84抗性[J].中國稻米，2024，30（6）：105-109.

[12] 汪文娟，陳凱玲，楊健源，等.廣東省不同稻區(qū)稻瘟病菌生理小種鑒定及無毒基因分析[J]：植物保護(hù)學(xué)報，2024，51（3）：645-653.

[13]劉文德，代玉立，邵小龍，等.我國主要農(nóng)作物病害災(zāi)變機制與綜合防控研究進(jìn)展：2018年-2022年[J].植物保護(hù)，2023，49（5）：1-31.

[14]田傳玉，方妍力，沈晴，等.2019-2021年我國南方稻區(qū)白葉枯病菌的毒力與遺傳多樣性調(diào)查研究[J].植物學(xué)報，2023，58（5）：743-749.

[15] Yang Wenjing，Chen Chao，Jiang Xiaolong，et al. CACNA1Bprotects naked mole-rat hippocampal neuron from apoptosisvia altering the subcellular localization of Nrf2 after 60Coirradiation[J].Cell Biology International，2024，48（5）：695-71.

[16] 蘇浩天，劉曼，尹淑霞.草地早熟禾 PpMYB2 基因的克隆、生物信息學(xué)及亞細(xì)胞定位分析[J]：草地學(xué)報，2024，32（10）：3071-3079.

[17]溫海洋，朱紫童，湛佳偉，等.煙草轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY11基因克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)模式分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2024，39（3）：60-66.

[18] 江舟，錢子剛，張愛麗.金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及分析[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2020，34（6）：15-19.

[19]山草梅，葉蕾，張連虎，等.水稻抗?jié)摳€蟲基因OsRAI1的克隆及功能分析[J].生物技術(shù)通報，2021，37（7）：146-155.

[20] Kwak JS，LeeKH，Min WK，et al.The transmembranedomain of the rice small protein OsS1Fal isresponsible forsubcellularlocalizationanddroughttolerance[J].PlantBiology，2024，26（6）：1079-1087.

[21] Wang Y，Sun J，Deng C，et al.Plasma membrane localizedSEM1proteinmediates nentto sink ricetissues[J].The Plant Journal， 2022，109（3）：523-540.

[22]Rattana K，KoisoN，TodaE，etal.RegulatoryfunctionsofROSdynamicsviaglutathione metabolism and glutathioneperoxidase tivityin developingricezygote[J].ThePlantJournal， 2021，108（4）：1097-1115.

[23] 唐蕊，尹珊，陳凱露，等.羽毛針禾（Stipagrostis pennata）葡萄糖-6-磷酸-1-差向異構(gòu)酶基因SpG6P1E的克隆與表達(dá)分析[J].中國沙漠，2024，44（4）：126-136.

[24] 胡國豪，楊子平，劉銅，等.橡膠樹棒孢霉落葉病菌酵母單雜交cDNA文庫及CcCas5啟動子誘餌載體的構(gòu)建[J].植物保護(hù)，2024，50（5）：205-212.

[25] 陳一恒，李少楠，董天宇，等.葡萄VvCCD1b 基因克隆及與其啟動子互作的轉(zhuǎn)錄因子篩選 [J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2024，55（8）：2215-2224.

[26]梁浩，孫海，邵財，等．人參根系酵母文庫構(gòu)建及PgD14與Pgpht2-1的互作蛋白篩選[J].中國中藥雜志，2024，49（22）：6107-6118.

[27] 馬曉玲，陳佳昕，柏芮，等.乙烯誘導(dǎo)的油茶酵母cDNA文庫構(gòu)建及 CoFAD7上游調(diào)控因子篩選[J]．植物生理學(xué)報，2024，60（8）：1301-1309.