基于響應面法和模糊數學法優化“火焰無核”葡萄果醋發酵工藝

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.020

中圖分類號：TS205.5 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0144-08

Optimization of Fermentation Process of “Flame Seedless”Grape Fruit Vinegar Based on Response Surface Methodology and Fuzzy Mathematics

CAO Ying1，ZHANG Wen² ，LIN Jing² ，LIU Yu¹ ，NIAN Qing-yu1，WANG Xin- ?xin¹ CUI Xiang-long1，ZHANG Zhen-zhen1 * （1.College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi ， China；2.Horticultural Crops Research Institute，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 83oooo，China）

Abstract： In this experiment，with local fresh grape“flame seedless”from Xinjiang as the research object，single factor test is conducted on fermentation temperature，initial pH value and initial alcohol content，response surface optimization test is conducted with fuzzy mathematics sensory score and total acid content as the evaluation indexes，and the optimal combination of parameters in the acetic acid fermentation process of “flame seedless” grape fruit vinegar is determined to be fermentation temperature of 35°C ，initial pH value of 4.6，and initial alcohol content of 7.3% vol. Under these conditions，the sensory score is 87.18 points. After this treatment，the obtained grape fruit vinegar has strong fruit vinegar flavor，presenting clear and transparent light amber hue with a slight dark color，and the aroma is mild.

Key words：“flame seedless\"; fruit vinegar; fuzzy mathematics method; response surface

“火焰無核\"葡萄果實口感酸甜適中，果肉松脆，果皮易消化，因此深受消費者喜愛[。而隨著鮮食葡萄種植面積的不斷增加和產量的不斷提高，常存在滯銷的狀況，嚴重影響了農民收入水平的提高和鮮食葡萄產業的發展，而葡萄果醋已有成功的生產經驗，在國內也有廣闊的市場前景[2」。

葡萄果醋是一種富含有機酸的調味品或醋酸飲料[3]，經過現代生物發酵工藝制作而成。它不僅含有原料“火焰無核”中的檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸，而且含有乙酸、乳酸、丙酮酸等[4發酵過程中產生的有機酸。“火焰無核\"果醋中的有機酸有助于人體內的新陳代謝，促進有氧代謝，消除和緩解疲勞[5]。此外，乙酸的高濃度也能產生某種程度的抑菌效果[6]。

以新疆當地品種“火焰無核\"葡萄作為基礎材料，經過酵母菌與醋酸菌發酵過程，成功制成了一種新型的葡萄果醋產品。在此基礎上，運用模糊數學法對其進行更公正的評估。同時，使用Box-Behnken試驗設計進行響應面分析，以此進一步優化“火焰無核\"葡萄果醋中的醋酸發酵環節，從而構建一整套提高鮮食“火焰無核”葡萄果醋質量的生產流程。

1材料與方法

1.1材料

“火焰無核\"葡萄：新疆農業科學院綜合試驗場葡萄示范園。

1.2試劑

偏重亞硫酸鈉、葡萄糖：天津市致遠化學試劑有限公司；果膠酶：法國Laffort公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；滬釀1.01凍干菌種、滬釀1.01液體培養基：上海市工業微生物研究所；氫氧化鈉、酚酞：天津市光復科技發展有限公司；酵母膏、瓊脂：北京市奧博星生物技術有限責任公司；無水乙醇：天津市科密歐化學試劑有限公司；碳酸鈣：天津市鑫鉑特化工有限公司。

1.3 儀器與設備

E203E/O2電子天平、FE28FiveEasy PluspH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫療儀器有限公司;BC/BD-320HK海爾臥式冷藏冷凍轉換柜青島海爾特種電冰柜有限公司；PAL-2手持糖度計日本ATAGO公司；ZSHPS-2葡萄除梗破碎機新鄉市衛濱區中食環機械有限公司；GQS-80-1螺桿泵新鄉市新輕機械有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1“火焰無核\"葡萄果醋釀造工藝流程

原料 $$ 除梗、破碎 $$ 酒精發酵 $$ 醋酸發酵 $$ 殺菌 $$ 成品。

1.4.2 操作要點

原料挑選：挑選新鮮且表面無病蟲害的鮮食葡萄。

酒精發酵：將原料破碎后加偏重亞硫酸鉀 Ω?80mg/L） 處理， 30min 后加入果膠酶（ 20mg/L） ，然后進行活化酵母（加原汁在 35～38^°C 活化 后加入酵母 200mg/L 并攪拌，發酵數天，直至酒精度示數增加緩慢。

醋酸發酵：醋酸菌活化：將滬釀1.01凍干菌種從無菌超凈臺上接種到液體培養基中。在 30°C 條件下以2 000r/min 振蕩活化 3d_。

醋酸菌擴培：在滅菌后的葡萄酒中添加 15% 的一級菌種培養液，將醋酸菌接種到含有葡萄糖 10.0g/L. 酵母膏 10.0g/L. 碳酸鈣 15.0g/L， 無水乙醇 20.0mL/L 、瓊脂 20.0g/L 和蒸餾水 1.0L/L 的液體培養基中。接種后用4層紗布封口，在 2 000r/min?30°C 下振蕩培養2d，總酸度需達到2%以上[7]。

殺菌：在醋酸發酵結束后，將醋液在 100^°C 下進行30s的殺菌處理。

1. 4.3 單因素試驗

通過觀察總酸變化規律和趨勢來判斷不同處理間的差異，為后續響應面試驗提供最優條件范圍。

1. 4.3. 1 發酵溫度

依照1.4.2中的方法進行發酵，初始酒精度為 7%vol 同時調整起始pH值至4.5，然后將其置于20，25，30，35，40^°C 的恒溫培養箱內保持恒定溫度進行發酵，每24h 測量一次總酸含量，直至總酸含量達到穩定的水平，即發酵完成。最后，通過對總酸含量的分析選擇最適宜的發酵溫度。

1.4.3.2 初始pH值

依據1.4.2中的方法進行發酵，初始酒精度為 7%01 同時對該產品在不同初始 pH 值（3.5，4，4.5，5，5.5）和 恒定溫度下進行發酵，并在每個階段間隔 24h 測量一次總酸含量，直至總酸含量達到穩定的水平后停止發酵，通過觀察總酸含量的變化，選擇最優的初始 pH 值。

1. 4.3.3 初始酒精度

按照1.4.2中的方法進行發酵，設置初始酒精度分別為 5%vol.6%vol.7%vol.8%vol 和 9%vol ，同時保持初始pH值為4.5，并在 下持續發酵，每 24h 測量一次總酸含量，直至總酸含量的變化趨于平穩，即發酵完成。依據總酸含量選擇最優的初始酒精度。

1.4.4 響應面優化試驗設計

通過單一變量試驗研究和分析“火焰無核\"葡萄果醋酸度的變化情況，采用Box-Behnken法進行試驗設計的優化，從而明確影響發酵過程的各種參數值，并且構建預測模型。響應面試驗設計結果見表1。

表1響應面試驗設計因素水平

1.4.5 模糊數學法評價標準

以色澤、香氣、組織狀態和滋味來評價果醋的優劣，其中色澤和組織狀態的權重各占0.15，而香氣和滋味的權重各占0.35。得到的因素權重集 X={0.15 0.35，0.15，0.35} 。評估結果劃分為優秀（90分）、良好（70分）與較差（50分）3個級別，從而構建了包含這3個級別的評估等級集合 T={90，70，50} 。邀請10名評審人員依照預設的標準和評分方式對各單因素的鮮食“火焰無核\"葡萄果醋進行主觀評價。感官評價標準見表2。

對數據進行計算和評估后，運用模糊數學理論對結論進行深人研究。首先，將4個項目中3個級別中每個等級所對應的人數與所有參與評分的總人數（即10人）相除，從而得到模糊數學關系的矩陣 R 。然后，從該矩陣中得出模糊的關系評價集 Y=X×R ，最終算出“火焰無核\"葡萄果醋的模糊數學綜合評分 Z=Y+T 。

1.4.6理化指標的測定

理化指標的測定是評估食品質量的重要步驟。參考GB12456—2021標準測定總酸含量[8]。參考GB5009.225——2023標準測定酒精度[9]。使用 pH 計測定 pH 值。根據GB5009.7—2016標準，對葡萄果醋中的還原糖含量進行測定[10]。可溶性固形物含量采用手持折光儀測定。通過以上方法可以準確評估果醋的理化指標，確保食品質量符合標準要求。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果分析

2.1.1發酵溫度對總酸含量的影響

根據1.4.3.1單因素試驗中的方法，不同發酵溫度下，隨著發酵時間的延長總酸含量的變化情況見圖1。

發酵溫度可以通過影響醋酸菌細胞的蛋白質結構與酶活性來影響其生長代謝和發酵性能，是果醋發酵的重要影響因素之一[1]。不同發酵溫度對“火焰無核\"葡萄果醋總酸含量的影響見圖1。

由圖1可知，當溫度為 時，隨著發酵溫度的升高，產酸量逐漸升高，但當發酵溫度進一步升高時，結果則相反，可能是高溫加速了醋酸菌的老化，導致其產酸量降低。在不同發酵溫度下，味覺評分與總酸含量的變化趨勢一致，呈現先增加后減少的趨勢。高溫發酵導致醋酸菌內乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性降低，同時加速了醋中風味物質的揮發，從而使味覺評分受到負面影響[12]。

2.1.2初始 pH 值對總酸含量的影響

適宜的 pH 值能維持醋酸菌的生長代謝，從而保證其有氧發酵和產酸的正常進行[13]。根據1.4.3.2單因素試驗中的方法，在不同 pH 值條件下，隨著發酵時間的增加，總酸含量的變化情況見圖2。

由圖2可知，隨著初始 pH 值的升高，產酸量呈現上升趨勢，但當初始 ΔpH 值繼續升高時，總酸含量下降。初始pH值過高對醋酸菌生長不利，且會解除NADPH₂ 和 NADH₂ 對乙酰CoA合成酶的抑制作用，導致過氧化現象的發生[13]。當發酵液的初始pH值過低時，會抑制菌種的新陳代謝，從而導致菌種發酵速率降低和產酸量下降[13]。通過分析圖2中數據，得出初始 ΔpH 值為4.5最合適。

2.1.3不同初始酒精度對總酸含量的影響

根據1.4.3.3中的方法對不同初始酒精度進行測試以觀察其對總酸含量的影響，結果見圖3。

由圖3可知，隨著初始酒精度的增加，總酸含量隨之先增加，直至在 7%vol 時達到最高值后下降。這一現象產生的原因在于適宜的酒精度有利于微生物的產生和繁殖，從而創造了適合它們生長的理想條件。通過分析圖3中數據，得出最佳的初始酒精度為 7% 。

2.2模糊數學評價結果

利用模糊數學綜合評價法，依據表2中的感官評價標準對“火焰無核\"葡萄果醋在各參數條件下進行感官評價，其評分情況見表3。

表3“火焰無核\"葡萄果醋的感官評分結果

通過對10位評價人員的評分結果進行分析，建立一個模糊矩陣來呈現不同樣品在色澤、香氣、組織狀態和滋味方面的評分差異。例如，1號樣品在色澤方面8位評價人員認為優秀，2位評價人員認為良好，沒有人認為差；在香氣方面，7位認為優秀，3位認為良好，沒有人認為差；在組織狀態和滋味方面也有相似的評價結果。這種差異性分析有助于更全面地了解樣品在不同方面的表現。

因此 （204號

0.000} ，最后計算出該樣品的感官評分 Z_?1=T×Y_?1= {90，70，50}×{0.765，0.235，0.000}=85.3 日

同理可得到評價結果集，見表4。

表4“火焰無核\"葡萄果醋的評價結果集

2.3 響應面優化試驗

根據Box-Behnken試驗設計，進行三因素三水平試驗，共構建了17組試驗。詳細的試驗設計與結果見表5[14-15]。

表6總酸含量的回歸模型方差分析及顯著性檢驗

注：“ ? \"表示影響顯著 （Plt;0.05） ；“ times? ”表示影響極顯著（ Plt;0.05） ；“一”表示影響不顯著 （Pgt;0.05） ，下表同。

根據表5中總酸含量的試驗數據對其進行二次多項回歸擬合，得到的回歸方程為 Y₁=61.61+1.20A+ 1.82B+1.77C+0.50AB+0.79AC+0.77BC-4.60A²- 3.83B²-4.62C² 。根據回歸方程，不同因素的變化對總酸含量的影響程度不同，其中 A，B，C 代表不同的因素，AB、AC、BC代表交互作用， A²，B²，C² 代表每個因素的平方項，這些參數可以幫助我們更好地理解不同因素對總酸含量的影響規律。

由表6可知，對于總酸含量而言，模型的 P 值 lt;0.01 表明模型極顯著。同時發酵溫度（A）和初始酒精度 （C） 之間存在顯著的交互作用；而初始 pH 值（B）和初始酒精度（C）也呈現顯著的交互作用。此外， R_Adj² 和 R_pred² 之間的差異小于0.2，表明模型有較高的精確性和穩定性[16]。失擬項的 P 值 gt;0.05 ，不顯著，進一步證明模型的擬合效果良好[16]。 R²=0.9951 表示模型能夠解釋高達 99.51% 的響應值變化。 F 值反映總酸含量受各因素的影響情況， F 值越高，表明該因素對總酸含量的影響越明顯。由此可見，各種因素對復合果醋總酸含量的影響主次順序為初始 pH 值 （B）gt; 初始酒精度 （C）gt; 發酵溫度（A）。

由圖4中的等高線圖和3D響應面圖可知，3種單因素對總酸含量有一定的影響，且各因素間的相互作用較大。從輪廓線和形態上看，線條密集度增加，形狀趨向橢圓形時，其影響程度也相應增加。在三維圖像上，傾斜度越大，交互作用越明顯。相反，各因素的交互作用較弱。

比較3個因素的等高線圖和3D響應面圖可知，發酵溫度（A）與初始酒精度（C）之間的交互作用較強，發酵溫度（A）與初始pH值 （B 及初始 pH 值 （B ）與初始酒精度（C）之間的相互作用較弱。

經優化試驗，發酵溫度 、初始酒精度7.218% vol、初始 ΔpH 值4.632為最佳工藝條件，此時總酸含量為 62.15g/L 。隨后的驗證試驗和模糊數學感官評分結果表明，總酸含量為 62.12g/L ，與預測值接近，驗證了試驗結果的準確性。

表7感官評分的回歸模型方差分析及顯著性檢驗

根據表7中感官評分的試驗數據對其進行二次多項回歸擬合，得到的回歸方程為 Y₂=88.76+1.90A+1.91B+ 1.66C-0.425AB+0.975AC+0.15BC-3.61A²-3.73B²- 3.83C² 。根據回歸方程，不同因素的變化對感官評分的影響程度不同，其中 A，B，C 代表不同的因素， 、BC代表交互作用， A²，B²，C² 代表每個因素的平方項，這些參數可以幫助我們更好地理解不同因素對感官評分的影響規律。

由表7可知，對于感官評分，模型的 P 值 lt;0.01 ，表明模型極顯著。同時發酵溫度與初始酒精度的交互作用顯著，而初始 pH 值與初始酒精度及發酵溫度與初始pH 值的交互作用不顯著。此外， R_Adj² 和 R_Pred² 之間的差異小于0.2，表示模型的精確性和變異性都比較高[16]。失擬項的 P 值 gt;0.05 ，不顯著，表明該模型有良好的擬合效果[16]。 R²=0.9899 顯示模型能夠解釋 98.99% 的響應值變化。 F 值反映感官評分的影響情況， F 值越高，表明對感官評分的影響越明顯。因此，各因素對復合果醋感官評分的影響主次順序為初始 ΔpH 值 （B）gt; 發酵溫度 （A）gt; 初始酒精度 （C） 。

由圖5中等高線圖和3D響應面圖可知，3個單因素對感官評分有一定的影響，且各因素間的交互作用較強。從輪廓線和形態上看，線條密集度增加，形狀趨向橢圓形時，其影響程度也相應增加。在三維圖像上，傾斜度越大，交互作用越明顯。相反，各因素的交互作用較弱。

比較3個因素的等高線圖和3D響應面圖可知，發酵溫度（A）與初始酒精度 （C） 之間的交互作用較強，發酵溫度（A）與初始 pH 值（B）及初始 pH 值（B）與初始酒精度（C）之間的交互作用較弱。

以感官評分為指標，發酵溫度 35°C 、初始酒精度7.348%vol 、初始pH值4.604為最佳發酵工藝參數，此時感官評分為87.67分。

2.4 響應面驗證試驗

以感官評分作為評價標準，對響應面的預估效果進行了測試。試驗在理想狀態下重復3次并設定以下條件：發酵溫度為 35°C ，初始 pH 值為4.604，初始酒精度為 7.348%vol 。考慮到實際情況，將這些條件調整為發酵溫度 35°C 、初始 pH 值4.6、初始酒精度 7.3% vol。為了檢驗優化方案是否有效，共進行3組試驗。最終結果顯示，經過該處理后的“火焰無核”葡萄果醋的感官評分達到87.18分，比預期的高，所以確定該優化方案可以應用于實際生產過程。對于總酸含量的響應面驗證試驗來說，最優評分為80.13分，表明僅憑總酸含量無法完全反映“火焰無核”葡萄果醋的味道特性。

3產品質量指標

3.1 感官指標

由最佳工藝條件制成的葡萄果醋呈現紅褐色，光澤明亮，散發濃郁的葡萄果香和醋香，醋液清澈透亮，無任何懸浮物和雜質，口感酸而不澀，醇厚柔和。

3.2 理化指標

通過測定葡萄醋的 ΔpH 值、總酸含量、還原糖含量和可溶性固形物含量發現，“火焰無核”葡萄果醋的pH 值為 3.95±0.79 ，總酸含量為 （57.38±0.67）g/L 還原糖含量為（ 1.85±0.40 ） mg/mL ，可溶性固形物含量為 （9.51±0.31 ） g/100mL ，經檢測，“火焰無核\"葡萄果醋的理化指標符合NY/T2987—2016《綠色食品果醋飲品》[17]的要求。

4結論

本研究首先通過單因素試驗考察了“火焰無核”葡萄果醋的發酵溫度、初始pH值、初始酒精度對總酸含量的影響，然后以“火焰無核”葡萄果醋的總酸含量和感官評分為指標進行響應面優化試驗，發現不能用總酸含量來判斷“火焰無核”葡萄果醋的風味品質。最后，確定以感官評分作為衡量葡萄果醋風味品質的指標，制備該“火焰無核\"葡萄果醋的最佳條件為發酵溫度35°C 、初始pH值4.604、初始酒精度 7.348%vol ，此條件下感官評分為87.67分。發酵的葡萄果醋的果醋味道較濃厚，為澄清明亮的淡琥珀色，香氣較柔和。

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