不同菌種發酵蘋果酵素抗氧化性的動態變化及其品質研究

關鍵詞：蘋果酵素；抗氧化性；品質；不同菌種；自由基清除能力

中圖分類號：TS255.4 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2025）06-0555-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2025.06.011

Dynamic Changes in Antioxidant Activity and Quality of Apple Ferments Fermented byDifferentStrains

ZHANG Haiyan，KANG Sanjiang，YUAN Jing，GOU Lina，SONG Juan （Agricultural Product Storageand Processng Research Institute，Gansu Academyof Agricultural Science. Lanzhou Gansu 730070，China）

Abstract：Understandingtheefectsoffermentationbydiferent microbialstrainsontheantioxidantactivityandqualityof aplefermentsprovidesregulatorystrategiesforthedevelopmentofhigh-qualityapplefermentproducts.Applefermentswere prepared using Cyberlindnera fabianii （Cf）， Saccharomyces cerevisiae （Sc），Cf + Sc，Lactiplantibacillus pentosus （Lp）， Leuconostoc mesenteroides （Lm），Lp+Lm，and Cf + Sc+Lp+Lm as fermenting strains.The dynamic changes in free radical scavenging capacity during fermentation，specifically DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）， O₂^?- （superoxide anion）， ·OH （hydroxyl radical），and ABTS （2， 2^′ -azino-bis-3-etybenzothzoline-6-sulfoicacid），wereaalyzd，andualityparameteswereevauatedandeedsults showed that DPPH， O₂^?- ，·OH，and ABTSscavengingabilities of Cf and Sc fermentation broths peakedon dayO; Lpand Lm broths peakedonday2O; Cf+ScandLp+Lmpeakedattheendoffermentation （day30），withvalueshigherthanothertreatments.TheCf + （20 （204 _Sc+Lp+Lm treatment maintained high scavenging capacities throughout fermentation and reached 79.88% ， 73.39% ， 78.21% ，and （204號 72.73% ，respectively，attheend.Thistreatmentalsoexhbitedsignificantlyigherlevelsofsolublesolids，totalacid，ducingpowe， superoxide dismutase （SOD） activity，and sensory evaluation scores（ Plt;0.05 ），with significantly lower pH compared to other treatments. According to the QB/T 5323-2018 standard forplant enzyme，all indicators of the Cf + Sc +Lp+Lmfermented apple ferments met the required specifications.

Key Words：Apple ferment; Antioxidant capacity; Quality; Different strain; Free radical scavenging capacity

甘肅省隴東黃土高原區和天水隴南淺山丘陵區屬暖溫帶半濕潤半干旱氣候，生產的蘋果以著色鮮艷、外觀美觀、肉質細脆、口感好、風味佳、耐貯藏、營養豐富，暢銷國內外市場[1]。2023年，全省蘋果種植面積穩定在25.62萬 hm² ，產量達511.32萬t，全產業鏈產值達560億元，有效助推產業興旺，助力鄉村振興[2]。但蘋果產業發展仍處在簡單分級包裝的初級加工階段，精深加工能力不足總產量的 10% ，限制了產業總體效益的提升[3]。經過預處理的蘋果原料在特定溫度下進行一定時間的微生物發酵制成的蘋果酵素，含有豐富的小分子活性物質和營養物質［4-5]，具有調節腸道菌群、抗氧化等改善健康的作用［6-7]，因此，積極推進蘋果酵素加工蘊藏著巨大的發展潛力。

近年來，諸多學者對酵素產品的研究開發方面開展了大量研究，對于蘋果酵素的研究大多集中在自然發酵酵素代謝產物和活性物質的變化以及發酵工藝條件優化等方面，楊小幸等［8]研究發現，自然發酵 30d 蘋果酵素的有機酸、糖類、總酚等代謝物質在21d達到最大值；崔國庭等［9通過優化蘋果酵素 24h 發酵工藝，為食用酵素的工業化生產提供了理論依據；康曉樂等［\"]采用宏基因組技術闡明了自然發酵蘋果酵素中微生物的動態變化及其多樣性機制；劉秀娟等[］通過考察酵母菌和乳酸菌的接種順序、接種時間以及發酵時間對總酸和SOD活性的影響，優化出了混菌發酵蘋果酵素的發酵工藝參數。本課題組長期開展蘋果酵素的發酵工藝、代謝產物變化以及微生物多樣性等研究［12-15]，并在前期研究中優化出了以費比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii，Cf）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae，Sc）、戊糖乳植物桿菌（Lactiplantibacilluspentosus，Lp）、腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，Lm）為發酵菌種的蘋果酵素發酵工藝，但有關上述不同菌種對蘋果酵素抗氧化性變化及其品質影響的研究尚未見報道。因此，本試驗選擇費比恩塞伯林德納氏酵母、釀酒酵母、戊糖乳植物桿菌和腸膜明串珠菌為發酵菌種，開展單菌種（Cf、Sc、Lp、Lm）、混菌（ Cf+Sc 、 Lp+Lm ）及多菌種（ Cf+Sc+Lp+Lm ）等不同菌種發酵蘋果酵素抗氧化性的動態變化及其品質研究，以期為開發高品質蘋果酵素提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料與試劑

供試蘋果購自甘肅省平涼市靜寧縣。供試發酵菌種為費比恩塞伯林德納氏酵母（Cf、釀酒酵母（Sc）、戊糖乳植物桿菌（ ）、腸膜明串珠菌1 Lm ），均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。供試DPPH自由基清除能力試劑盒、·OH自由基清除能力試劑盒、 O₂^?- 自由基清除能力試劑盒、ABTS自由基清除能力試劑盒均購自蘇州夢犀生物醫藥科技有限公司。

1.2儀器與設備

LRH-70型恒溫培養箱由上海一恒科學儀器有限公司提供；BXM-90FE立式壓力蒸汽滅菌器由上海博迅醫療生物儀器股份有限公司提供；MDF-U3386S超低溫冰箱由青島海爾集團提供；DL-CJ-1N超凈工作臺由北京東聯哈爾儀器制造有限公司提供；GS-MFC4005S四聯5L平行生物反應器由上海顧信生物科技有限公司提供；Spectra-Max190酶標儀由美國MolecularDevicesCorporation（MDC）公司提供。

1.3試驗方法

新鮮蘋果清洗干凈用純凈水沖洗后瀝干水分，冰糖、刀具等相關配料及器血在紫外燈下照射30min 。蘋果縱切4瓣后去核、再橫切分成厚 4mm 左右的片，按料液比 200：1（g：L） 將蘋果片與純凈水投進5L的生物反應器中，加入冰糖將糖度調節至 15.0°Brix ，同時制備7份，分別記為Cf、Sc、Cf+Sc 、Lp、Lm、 Lp+Lm 、 Cf+Sc+Lp+Lmgt; 個處理。分別在標記Cf、 s_c 、 Cf+Sc 發酵液中接入活化好的3% Cf、 3% Sc、 3%Cf?Sc （體積比為 1：0.2 ，于24±1°C 條件下發酵 30d ；分別在標記Lp、Lm、Lp+Lm 發酵液中接入 5%Lp 、 5%Lm 、 5%Lp+Lm （體積比為 1：1 ），于 33±1°C 條件下發酵 30d ：在 發酵液中按 3% 的總接種量先接人 Cf+Sc （體積比為 1：0.2. ，于 24±1°C 條件下發酵 10d ，采用碳酸鈉將 pH 調節至5.0，再以 5% 的總接種量接人 5%Lp+Lm （體積比為 1：1 ），于33±1C 條件下發酵 20d 。每處理重復3次。

1.4抗氧化指標測定

參照 Li^[16] 和Gulcin等［17]的方法測定抗氧化指標1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-

2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯氮-雙-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸［2，2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid），ABTS]、羥基（ ?_0H） 和超氧陰離子 （O₂^?-） 自由基。每5d取樣1次，每次取樣 5mL ，每個樣重復3次。

1.4.1DPPH自由基清除能力測定根據試劑盒說明書加入各試劑，置冰上避光靜置 30min ，515nm 波長下測定吸光度。以自由基清除率表示。

DPPH自由基清除率 （OD空白-OD測定）/OD空白 ×100% 1.4.2·OH自由基清除能力測定按試劑盒操作說明書加入各試劑，混勻后 37^°C 恒溫反應60min ，雙蒸水調零，測定 536nm 波長下的吸光度。羥自由基清除率計算公式如下。

羥自由基清除率=（OD測定-OD對照）/（OD空白-OD對照） ×100% 1.4.3 O₂^?- 自由基清除能力測定根據試劑盒操作說明測定，將各試劑加入96孔板，混勻后 25^°C ，10000g 離心 5min ，吸取上層水相，測定 530nm 波長下的吸光度。超氧陰離子自由基消除率計算公式如下。

超氧陰離子自由基清除率 （OD空白-OD測定）/OD空白 ×100% 1.4.4ABTS自由基清除能力測定根據試劑盒操作說明書將各試劑加入96孔板，混合后避光靜置反應 5min ，測定 734nm 波長下的吸光度。ABTS自由基清除率的計算公式如下。

ABTS自由基清除率 （OD空白-OD測定）/OD空白 ×100%

1.5 品質指標測定

對發酵 30d 的Cf、Sc、 Cf+Sc 、Lp、Lm、 Lp+ Lm、 發酵液分別進行品質測定。采用 pH 計測定 ΔpH ；采用糖度計測定可溶性固形物含量[5]；采用酸堿滴定法測定總酸含量[5]；參照王宇晴等［18]的方法測定還原力；參照GB/T5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶活性》的測定超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）活性［19]；感官評價參照徐麗等[20]的方法，從樣品的組織狀態、口感、滋味、色澤、香氣等5個方面對蘋果酵素產品進行感官評分，采用10分制。

1.6產品品質判定

根據QB/T5323—2018《植物酵素》標準對蘋果酵素產品品質進行檢驗判定[21]。

1.7 數據分析

使用SPSSStatistics27對數據進行統計分析處理，并進行Duncan檢驗方差分析，采用MicrosoftExcel2016軟件制圖和制表。

2 結果與分析

2.1不同菌種對蘋果酵素抗氧化性動態變化的影響

抗氧化性是指化合物在化學反應中阻止或減緩自由基氧化過程的能力，抗氧化物質的主要功能是減少細胞結構、蛋白質結構、組織結構，甚至DNA結構受到自由基的損害［22]。通過測定DPPH、 、·OH和ABTS自由基清除能力來評價蘋果酵素發酵液的抗氧化活性，通過圖1不同菌種發酵蘋果酵素的抗氧化性在整個發酵過程中的動態變化可以看出，DPPH、 、·OH和ABTS自由基清除能力在發酵過程中的變化趨勢基本一致，Cf、Sc、Lp 和 Lm 發酵液處理的DPPH、 0₂^?- 、·OH和ABTS自由基清除能力隨發酵時間的延長先升高后緩慢降低，而 Cf+Sc 、 Lp+Lm ！ Cf+Sc+Lp+Lm 處理的4種自由基清除能力則隨發酵時間的延長逐漸升高。發酵 30d 后各發酵液發酵的4種自由基清除能力以 處理最高，其次為Lp+Lm 處理， Cf+Sc 處理排第3，Lp、Lm、Sc、Cf處理較低。Cf、Sc處理的4種自由基清除能力均在發酵10d時達到最高，Lp、Lm 處理在第 時達到最高， Cf+Sc ！ Lp+Lm ： 處理在發酵 30d （發酵結束）時達到最高值，其中 處理在發酵 20d后的DPPH、 O₂^?-， （ΔOH 、ABTS自由基清除能力均保持在最高水平，發酵結束時分別達到 79.88% 、 73.39% 、 78.21% ！72.73% ，遠高于其他發酵液。說明多菌種發酵（ 發酵液處理）更有利于提高蘋果酵素發酵液的抗氧化性，這與 Peng 等［23]在蘋果汁多菌種發酵中的研究結果相似。

2.2不同菌種對蘋果酵素品質的影響

可溶性固形物含量、 pH 、總酸含量是衡量蘋果酵素發酵成熟的主要指標，并與還原力、SOD活性和感官評價等一起，作為反應酵素品質的重要指標［24]。由表1可以看出，不同菌種對蘋果酵素各發酵液的可溶性固形物、 ΔpH 、總酸含量、還原力（ 0D_700nm 值）、SOD活性、感官評價等品質指標影響不同。 處理的總酸含量、還原力（ OD_700nm 值）、SOD活性、感官評價均最高；Lp+Lm 處理還原力（ ΔOD_700rm 值）、SOD活性、感官評價與 Cf+Sc 處理差異均不顯著（ Pgt;0.05 ），與其他處理差異顯著（ Plt;0.05 ；總酸含量與 Lp 、Lm處理差異不顯著（ Pgt;0.05 ），與其他處理差異顯著（Plt;0.05 ）。

可溶性固形物含量以 處理最高，顯著高于其他處理（ Plt;0.05 ）；其次是 Cf+Sc 處理，與 Lp+Lm 處理差異不顯著（ Pgt;0.05 ），與其他處理差異顯著（ Plt;0.05 ）。Cf、 sc 、Lp、Lm處理的可溶性固形物含量、還原力、SOD活性和感官評價之間的差異均不顯著（ Pgt;0.05 ）； Lm 處理的總酸含量顯著高于Cf、Sc處理（ Plt;0.05 ）， Lp 處理與 s_c 處理差異不顯著 ?Pgt;0.05 ），與Cf處理差異顯著（ Plt; 0.05），這可能與其發酵產生大量的乳酸有關。Cf處理的 pH 最高，且顯著高于其他處理（ Plt;0.05 ； Cf+ Sc+Lp+Lm 處理最低，且顯著低于其他處理（ Plt; 0.05）。這可能是由于多種微生物之間可以形成互利共生關系，有利于蘋果酵素的發酵過程并提高品質，這與Olanbiwoninu等[25]的研究結論類似。

2.3蘋果酵素產品判定

根據抗氧化性和品質指標分析結果，選擇 發酵制備蘋果酵素，產品經渭南市產品質量監督檢驗所依據QB/T5323—2018《植物酵素》標準檢驗，感官要求、一般理化指標、特征性指標、污染物限量等各項指標均符合標準的要求（表2、表3）。

3討論與結論

百合酵素、山楂酵素、西梅酵素等許多植物酵素都具有較強的抗氧化功能，主要表現在較強的DPPH、 O₂^?- 、 ΔOH 、ABTS等自由基清除能力方面，其強弱可能是由原料自身和通過微生物發酵代謝產生的維生素C、花青素、酚類等抗氧化物質的變化引起的［26-28]。有研究表明，經過益生菌發酵，果蔬汁中的沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸等酚類物質的含量呈升高趨勢［29]，這可能與益生菌在發酵過程中消耗酚類化合物中的葡萄氧分子，去除多種酚類化合物的糖苷配基，導致酚類化合物發生轉化有關［30]。本試驗中，以費比恩塞伯林德納氏酵母（Cf）、釀酒酵母（Sc）、 Cf+Sc 、戊糖乳植物桿菌（ （Lp） 、腸膜明串珠菌（ Lm ）、 Lp+Lm 和 為發酵菌種制備蘋果酵素，研究DPPH、 O₂^?- 、 ΔOH 、ABTS自由基清除能力來評價不同菌種對蘋果酵素發酵液抗氧化活性動態變化的影響，并對其產品品質進行了檢測分析和檢驗判定。結果表明，在抗氧化活性動態變化比較分析中，不同菌種達到最大值的時間和自由基清除能力差異較大，Cf、Sc發酵液的DPPH、 0₂^?- 、·OH、ABTS自由基清除能力在發酵 10d 時達到最高，Lp、Lm發酵液在發酵 20d 時達到最高， Cf+Sc 1Lp+Lm 、 Cf+Sc+Lp+Lm 發酵液則在發酵結束時0 30d） 達到最高值， 發酵液中DPPH、0₂^?- 、·OH和ABTS自由基清除能力在整個發酵過程中基本保持在較高水平，發酵結束時分別達到79.88% 、 73.39% 、 78.21% 和 72.73% . 發酵液發酵的蘋果酵素DPPH、 0₂^?-. 、 Δ_0H 、ABTS自由基清除能力隨發酵時間的延長逐漸升高，且明顯高于其他各處理，說明多菌種發酵提高了蘋果酵素發酵液的抗氧化性，但不同菌種發酵蘋果酵素中酚類物質的動態代謝過程和機理尚不明確，有待于進一步研究。

菌種及其發酵性能是影響酵素產品品質和發酵過程可控程度的重要因素，選擇特定益生菌生產食用酵素以提高產品品質和發酵過程可控性已成為目前研究的焦點。優良的微生物菌群不僅能夠提高酵素的發酵效率并改善產品風味品質，還因其具有抗氧化、提高免疫力和改善腸道功能等獨特的益生功效，更好地提高了酵素產品的品質［31]。本研究發現，不同菌種發酵對蘋果酵素的可溶性固形物、 pH 、總酸、還原力（ ΔOD_700nm 值）、SOD活性和感官評價等品質指標的影響較大， 發酵液的可溶性固形物、總酸、還原力、SOD活性和感官評價的差異均顯著高于其他處理（ Plt;0.05| ），pH 顯著低于其他處理（ Plt;0.05 ），且各項指標均符合QB/T5323—2018《植物酵素》標準的要求，這可能是由于蘋果酵素發酵過程中酵母菌和乳酸菌之間存在代謝互補機制，不僅能夠保護酵母菌避免自溶以及受外界環境影響，并能促進乳酸菌的動態平衡，同時優勢菌產生的代謝產物促進了微生物的生存和生長，有效控制發酵過程的同時，提高了酵素產品的營養價值[32]。然而，雖然近年來對部分產品的代謝產物做了大量研究分析，但是食用酵素繁雜的代謝途徑和代謝機制尚未明確，可以通過多組學聯合技術在該方面加強研究[33]。同時，基于本實驗中，發酵 30d 的 發酵液的 DPPH、 0₂^?- 、 ΔOH 、ABTS等自由基清除能力和品質均較好，因此，可繼續延長發酵時間以確定是否能進一步提高蘋果酵素產品的抗氧化性及品質。

綜上，參試7組不同的菌種中， 發酵蘋果酵素具有較高的抗氧化活性和品質，是適宜蘋果酵素發酵的菌群，酵母菌和乳酸菌在發酵共同在促進微生物共生、提高代謝產物含量和改進品質等方面起著重要的作用，同時根據不同菌種達到最大值的時間和能力的差異，進一步優化蘋果酵素發酵工藝，以期為高品質蘋果酵素的開發提供調控策略，同時也為酵素產業的發展奠定良好的理論基礎。

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