山東日照煙草鐮刀菌根腐病鑒定及其防治藥劑篩選

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）10-0133-06

煙草鐮刀菌根腐病（Tobaccofusariumrootrot）是由鐮刀菌屬真菌引起的、發生在煙草上的具有潛在危害的根部病害[1]。自20 世紀70 年代起，國外便開始報道鐮刀菌可引起作物發生根腐病，相應病癥先后在加拿大、美國、日本、澳大利亞、印度、意大利等國家發現[2-4]。國內的研究相對較晚，該類病害在湖北、福建、河南、山東、云南等地區的研究相對較早[5-9]。由于栽培制度、生產方式及煙草生產品種的改變，這種病害已經成為危害煙草根莖的嚴重病害之一，在國內各個主栽煙區普遍發生，并且呈現逐年上升的趨勢，制約了我國大部分主栽煙區煙草產業的可持續發展[10]。煙草鐮刀菌根腐病的病原種類多，易傳播，防治難，在煙草幼苗期及大田期間均可以發生。病菌侵染煙草根莖后，導致根系維管束腐爛，最終使煙株枯萎死亡。在大田期，煙草鐮刀菌根腐病的癥狀主要表現為植株發育不良、莖稈纖細、葉片失綠，發病嚴重時，莖稈內木質部變黑、腐爛[3]。該病害在我國的發病率一般為 3% ＼～5% ，而福建省、河南省的煙田發病嚴重時發病率高達 30%^[11] 。煙草鐮刀菌根腐病不僅可以由單種或多種鐮刀菌引起，而且植株感病后會加重煙草青枯病、煙草黑脛病等其他根莖類病害的發生，導致煙草的產量、質量大幅度降低，對當地煙區造成極大損失。

山東省日照市莒縣寨里河鎮有著多年的烤煙種植歷史，是烤煙的主要產區之一，烤煙種植也是該鎮的重要特色農業項目。于2021—2022年6—7月進行的病害調查發現，龍尾村煙田普遍發生一種由根黑壞死引起的、表現為地上部煙株枯萎死亡癥狀的根腐病;由于該病害發生時期較早，且發病部位隱蔽，一旦地上部呈現癥狀，病害發生已經非常嚴重，對當地的煙葉產量和質量造成了較大威脅。因此，正確識別病害和篩選低毒、高效的殺菌劑非常必要。

為了探明日照市莒縣新發生的煙草根腐病病原，篩選高效、低毒的殺菌劑，本研究擬通過田間觀察，對該病害的典型癥狀進行描述和識別。首先，對采集的病根樣品進行病原分離及致病性測定，結合病原菌培養性狀、顯微形態特征及分子生物學鑒定，確定病原物種類；同時，通過室內藥劑的毒力測定，獲得可用于病害防治的高效低毒藥劑，以期為日照煙區煙草鐮刀菌根腐病的田間診斷和生產中病害的防治提供科學依據。

1材料與方法

1.1 病根采集與病原分離

2022年7月，在山東省日照市莒縣寨里河鎮龍尾村煙田調查煙草根腐爛病的發生情況，并采集具有典型癥狀的病株根系，觀察并記錄癥狀。采用常規組織分離法分離病原菌[12]。分別從2個發病煙田采集2個病根，用自來水沖洗病株根部表面后，在病健交界處切取數個大小約 0.3cm×0.5cm 的組織塊，用 5%NaCl 溶液 .75% 乙醇溶液進行表面消毒40s 后，再用無菌水沖洗3次，吹干表面水分。將表面消毒的組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板上，于 28^°C 恒溫培養5d后，挑取優勢、典型的單菌落，經單孢分離，進一步在PDA培養基中純化，取菌餅置于 20% 甘油溶液中于 -80°C 保存、備用。

1.2 致病性測定

采用孢子懸浮液灌根接種法進行接種。用適量無菌水沖洗預先活化7d的供試菌株平板表面后，用無菌紗布過濾并收集孢子懸浮液，將孢子懸浮液濃度調整為 10⁵ 個 ΔmL 。在供試煙苗K326（4葉1心期）根圍接種孢子懸浮液，每株用量為 15mL ，以接種等量無菌水的處理作為對照。每個菌株接種6株，共重復3次，接種后將煙苗置于人工氣候室（ 26°C 、相對濕度 70% ，光一暗周期 12h-12h ）內觀察， 8d 后觀察病害的發生情況，并從煙根發病部位再次分離病原菌。

1.3病原菌的形態觀察

參照邱睿等的方法[7]，從菌落邊緣切取直徑為5mm 的菌塊于新培養基中活化，在 28^°C 黑暗條件下培養7d，觀察并記錄菌落培養性狀；用無菌鑷子挑取菌絲，置于添加體積分數為 30% 的無菌甘油的載玻片上，在光學顯微鏡（型號：蔡司AxioScopre.A1）下觀察病原菌的菌絲形態及分生孢子的形態特征。

1.4病原菌的分子鑒定

參照邱睿等的方法，從剛活化的菌板邊緣取1塊 5mm 大小的菌塊接種至 200mL PDB液體培養基中，于 200r/min?28°C 黑暗條件下振蕩培養5d，用紗布將培養基過濾并收集菌絲體，用吸水紙吸干菌絲表面的水分后稱重。將菌絲用液氮研磨后按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取菌株總DNA。采用內轉錄間隔區（ITS）、翻譯延伸因子 1-α （ TEF-1α） 基因序列進行鑒定，擴增的目標片段經凝膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并通過BLAST比對同源性。采用MEGA7.0軟件構建系統進化樹，具體采用鄰接法，分析菌株的分類地位。

1.5室內殺菌劑抑菌活性的測定

選擇致病力最強的病原真菌菌株作為靶標菌，采用菌絲生長速率法測定6種供試殺菌劑（表1）的毒力[13]。對預先培養在PDA培養平板上的致病力最強的鐮刀菌菌株打取菌餅（直徑為 6mm ），將各供試藥劑設定成不同質量濃度梯度處理的含藥平板（表2），以無菌水作為對照。接種菌餅（ 5mm ）于不同濃度梯度的平板中央，在 28^°C 條件下黑暗培養5d，每個處理重復3次。采用十字交叉法測量不同處理的菌落直徑，計算菌絲生長抑制率、毒力回歸方程及有效抑制中濃度（ EC₅₀ 值）。

菌絲生長抑制率 =[1- （處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑） ]×100% 。

2 結果與分析

2.1 煙草根腐病的田間癥狀與危害

龍尾村煙草根腐病的發生部位為根部，且主要影響直根。地上部首先是葉片表現出癥狀，植株葉片按照從下至上的順序變黃枯萎，特別是葉尖、葉緣部位表現出明顯的枯萎、下垂癥狀，后期葉片全部萎蔫枯死，但不脫落，莖稈有壞死斑。根部直根系壞死，變黑，變細，須根相對較多，但較健康煙株的須根更纖細（圖1）。在大田后期，出現根腐癥狀的病株發生率相對較高，超過 50% ，局部發病嚴重的煙株整株枯萎、死亡，煙葉絕收（圖2）。

2.2病原菌致病性的測定

將分離的優勢菌株S1、S3菌株回接至K326煙苗根部8d后，煙苗地上部出現萎蔫失水的癥狀；接種后12d，煙苗地上部萎蔫，下部葉片變黃，整株生長得相對矮小，拔出煙苗發現，其根部的直根變細、變黑、壞死，對照煙苗則較為健康（圖3）。此外，S1、S3菌株的致病性相當。接種病原菌的煙草幼苗癥狀表現與根腐病田間癥狀基本一致，筆者從發病部位分離到與原始菌株培養性狀、顯微形態相同的病原真菌，從而完成科赫氏法則的證病過程。

2.3病原菌的分離及其培養特征

對分離到的優勢菌株進行單孢純化及形態特征相似性分析，共獲得3株真菌菌株，分別為S1、S3、S5（圖4）。其在PDA培養基上，3株菌株的菌落呈白色或微黃色，氣生菌絲生長旺盛、呈絮狀、放射狀生長;培養4d時的菌落直徑為 3.9～5.9cm 。大型分生孢子呈馬特形，兩端較尖，頂細胞稍彎，呈彎月形，有2～5個分隔，其中3個分隔的居多，長105.0～177.6μm ，寬 14.0～21.0μm （圖5）。初步判斷該分離菌株為鐮刀菌屬（Fusarium spp.）真菌。

2.4病原真菌的分子鑒定及其系統發育分析

用 通用引物對煙草根腐病菌的S1、S3、S5菌株進行PCR擴增并測序，將所得序列提交至NCBI網站上進行BLAST同源比對，基于

ITS、TEF-1α序列聯合構建發育樹。由圖6可知，S1 .53 、S5均與 F .solani聚為1支，且基因序列的一致性均在 99% 以上。結合顯微形態觀察結果，確定S1、S3、S5均為茄病鐮刀菌（F.solani）。

2.5供試殺菌劑的室內毒力測定結果

根據供試菌劑的室內毒力測定結果，獲得毒力回歸方程。由表3可以看出，除了 15% 噁霉靈水劑（無抑制效果）外，其他5種藥劑對茄病鐮刀菌的S1菌株具有不同程度的毒力，其中 40% 異菌·氟啶胺懸浮劑的抑菌效果最強， EC₅₀ 為 0.66μg/mL 29% 吡萘·嘧菌酯懸浮劑 、430g/L 戊唑醇懸浮劑、 40% 多菌靈懸浮劑的毒力作用相對亦較強，對煙草鐮刀菌的 EC₅₀ 分別為 1. 15?1. 25?1. 30μg/mL;25% 吡唑·醚菌酯懸浮劑的抑菌作用相對稍弱， EC₅₀ 為1.5μg/mL 。

3討論

隨著栽培制度、生產方式及煙草品種的改變，近年來煙草鐮刀菌根腐病的發生在國內各主栽煙區呈現增長的趨勢，對煙草行業構成的經濟損失逐年增加[14]。本研究采集煙草鐮刀菌根腐病樣品，通過組織分離、單孢純化的方法獲得病原菌株，通過形態學、分子生物學鑒定方法，將煙草鐮刀菌根腐病病原真菌鑒定為茄病鐮刀菌。鐮刀菌屬（Fusarium.spp）真菌在世界范圍內均有分布的絲狀真菌，無性時期屬于半知菌亞門，廣泛分布于土壤、有機體中。鐮刀菌對于農業生產具有重要意義，其中許多種是重要的植物病原菌，會引起許多重要農作物發生重大病害，導致農業生產損失嚴重。此外，鐮刀菌的寄主范圍廣泛，可侵染茄子、辣椒、小麥、大豆、三七、人參等多種植物，引起植物根腐、莖腐、穗腐等多種病害；鐮刀菌侵染煙草后也會造成鐮刀菌根腐病[15]。煙草鐮刀菌在幼苗至大田期均可造成侵染，從而引起作為根腐病。此外，鐮刀菌可以通過孢子萌發管、菌絲體侵入植物根部，在根部皮層內延伸生長，造成根系維管束腐爛，使煙株的養分、水分運輸受阻，進而枯萎死亡[16-17]。已有研究發現，造成煙草鐮刀菌根腐病的病原種類較多，主要有尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄病鐮刀菌（ F. solani）木賊鐮刀菌（F.eguiseti）等；我國不同煙區因氣候環境、土壤條件等因素不同，煙草鐮刀菌根腐病病原優勢菌具有地域性差異[14]。沈會芳等在廣東珠璣、始興等地區對病樣進行分離、鑒定，發現共享鐮刀菌（F.commune）的占比最高，為 42.2% [18]蓋曉彤等對云南省分離的300株病原菌進行鑒定，發現茄病鐮刀菌占比為 14.3% ，尖孢鐮刀菌占比為75.7% ，為主要優勢菌[9]。邱睿等對河南省主栽煙區鐮刀菌根腐病病原進行鑒定，發現茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌為當地主要病原菌[7，19]。趙杰等在山東萊蕪、蒙陰等主產煙區采集典型煙草根腐爛病株，經組織分離及病原鑒定，發現了茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、厚孢鐮刀菌（F.chlamydosporium）3個種，且茄病鐮刀菌占據優勢[8]。本研究結果證明，山東日照主栽煙區發生的煙草鐮刀菌根腐病病原菌為茄病鐮刀菌，與上述結果一致，充分說明茄病鐮刀菌是山東部分主栽煙區的鐮刀菌根腐病病原優勢種。

目前，化學藥劑仍然是生產中防治煙草鐮刀菌根腐病的主要措施之一，因其高效、便捷、經濟等優勢，成為煙草生產上不可或缺的防控措施，但是長期施用化學藥劑不僅會使煙葉中的農藥殘留超標，還會造成生態環境污染等一系列問題。隨著煙草鐮刀菌根腐病的發生逐年加重，針對病害的高效、環保的化學藥劑防治也越來越受到重視。孫正巧等對四川宜賓煙區分離到的尖孢鐮刀菌、共享鐮刀菌分別進行室內毒力測定，藥劑中氟啶胺的 EC₅₀ 分別為 0.1885.0.0589mg/L ，吡唑·醚菌酯的 EC₅₀ 分別為 1.2252.0.2979mg/L^[20] 。在本研究中，供試藥劑氟啶胺對茄病鐮刀菌的 EC₅₀ 為0.66μg/mL ，吡唑·嘧菌酯對應的 EC₅₀ 為1.15μg/mL ，與上述結果相似。同類藥劑對不同種類鐮刀菌產生毒力差異可能源自以下2個原因：一是不同廠家生產的同類藥劑有效成分有差異；二是不同地區、不同菌株對相同藥劑的敏感性有差異。目前，關于化學藥劑對茄病鐮刀菌毒力測定的研究較多，例如周雪敏等對于從橡膠樹中分離出的茄病鐮刀菌進行室內毒力測定，結果顯示， 50% 多菌靈可濕性粉劑的效果最好， EC₅₀ 為 0.7594μg/mL;95% 戊唑醇原藥的抑制效果相對較差， EC₅₀ 為 12.5892μg/mL 250g/mL 吡唑·醚菌酯乳油的抑菌效果相對最差，EC₅₀ 為 183.0474μg/mL^[21] 。本研究中， 40% 多菌靈懸浮劑 、430g/L 戊唑醇懸浮劑 25% 吡唑·醚菌酯懸浮劑對茄病鐮刀菌的 EC₅₀ 分別為 1.30.1.25 、1.15μg/mL，3 種試劑均有較好的抑菌效果，與前人的研究結果不一致，原因可能是藥劑的有效成分含量及不同地區菌株的活性具有差異。氟啶胺是一種保護性殺菌劑，針對稻瘟病、小麥銹病、小麥白粉病、番茄晚疫病等具有殺菌廣譜性[2，藥效持續時間長，施用方便，具有在作物和環境中易降解、安全等優勢[23]。常威等研究發現， 40% 氟啶胺·異菌脲懸浮劑對白術根腐病的田間防效較好，該藥劑對茄病鐮刀菌的抑制活性較高，生產上在該病害發生初期建議采用該藥劑通過灌根方式進行防治[24]。多菌靈（內吸性殺菌劑）戊唑醇（三唑類殺菌劑）、醚菌酯（甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑）的作用機制各不相同。結合本研究毒力測定結果，建議將上述3種藥劑與氟啶胺藥劑交替施用，以降低鐮刀菌對單一藥劑產生抗藥性的風險，提升對鐮刀菌根腐病的防控效果。期待本研究結果可為由茄病鐮刀菌引起的煙草鐮刀菌根腐病拓寬藥劑選擇范圍，為該病害的高效防控提供科學支撐。

4結論

本研究通過組織分離法從山東省日照市莒縣寨里河鎮龍尾村煙草（品種NC55）根部壞死癥狀的病株中分離到3株優勢真菌，通過科赫氏法則得以證明；基于ITS和 TEF-1α 序列結合菌株培養性狀、顯微形態特征，將病原菌鑒定為茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）。對6種供試藥劑進行篩選得出，對茄病鐮刀菌抑制效果最強的是 40% 異菌·氟啶胺懸浮劑，其他依次為 29% 吡萘·嘧菌酯懸浮劑、430g/L 戊唑醇懸浮劑、 40% 多菌靈懸浮劑 .25% 吡唑·醚菌酯懸浮劑。上述藥劑均可用于防治由茄病鐮刀菌引起的煙草鐮刀菌根腐病。本研究明確了日照莒縣發生的煙草根腐病病原并篩選獲得高效防治藥劑，可為了解煙草鐮刀菌根腐病病原種類分布及該病害的高效防控提供參考。

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