楊梅中5種殺菌劑多殘留檢測方法比對

關鍵詞：楊梅（MorellarubraLour.）；殺菌劑；農藥殘留；檢測方法；免疫層析法；比對中圖分類號：TS207 文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2025）07-0164-07DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.028開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：[

Comparative study of five fungicides multi-residue detection methods in Morella rubra Lour.

JIA Hui-yan，FU Yan，WANG Quan-sheng，WU Yin-liang （Ningbo Academy of Agricultural Sciences，Ningbo 315O4O，Zhejiang，China）

Abstract：Using MorellrubraLour.astheresearchsubject，fivefungicides withhighdetectionrates（carbendazim，difenocoazole， pyraclostrobin，azoxystrobin，tebuconazole）were srenedbasedonhistorical pesticideresidues monitoringdatafromthe Testing Centerof NingboAcademyof Agricultural Sciences.Asystematiccomparisonwas madeonthetechnicalperformanceoftwodetection methods：collidal goldimmunochromatographicrapiddetectionandultra-performanceliquidchromatography-tandemmasspectrometry（UPLC-MS/MS）.Theresultsshowedthatthedetectionlimitsoftheimmunochromatographymethodforthefivefungicideswere （20 0.20mg/kg （carbendazim）， 1.00mg/kg （difenoconazole）， 5.00mg/kg （pyraclostrobin）， 5.00mg/kg （azoxystrobin），and 1.00mg/kg （204 （tebuconazole），respectively.The detection limits of the UPLC-MS/MS method forallfive fungicides were 0.001mg/kg .When the spiked levels of the five fungicides in Morella rubra Lour. were 0.010～1.000mg/kg ，the UPLC-MS/MS method demonstrated good accuracy and precision. The average recoveries of the five fungicides ranged from 74.8% to 107.5% ，with relative standard deviations （ RSD ）between 1.1% and 9.0% .The immunochromatography method exhibited good precision.The 1-negative rate for the five fungicides was O，the 1-positive rate was ?5% ，and the relative accuracy was ?97.5% .Although the detection limits of the immunochromatographymethodwere higher，theywereallbelowthe maximumresiduelimits.This methodwasfullyaplicableforqualitative screening of pesticide residues and met the timeliness and reliability requirements foron-site rapid detection.

KeyWords：MorellrubraLour.;fungicides；pesticideresidues；detectionmethods；immunochromatographycomparativestudy

楊梅（MorellarubraLour.是中國長江中下游地區重要的特色經濟作物，果實風味獨特，同時還有藥用價值，內含多種抗氧化物和黃酮類化合物，具有消炎、抗過敏及對癌細胞的抑制等作用[12]。楊梅在中國種植廣泛，截至2021年底，全國楊梅種植面積約33.35萬 hm² ，對幫助農民脫貧致富具有重要的意義[3]。楊梅每年6、7月為成熟期，恰逢南方梅雨季節，病蟲害易發生。絕大多數楊梅在生產時會罩上羅幔，這種方式能有效防蟲害，減少殺蟲劑的使用，但卻不能防菌[4]。根據王華弟等[5.6]對浙江楊梅主產區的監測研究表明，嚴重危害楊梅生產的病害主要為白腐病、褐斑病和癌腫病。褐斑病導致葉片脫落，直接影響果實產量與品質；白腐病導致果實軟腐，后期干縮脫落，生產中常使用殺菌劑防治果實病害[7。由于楊梅屬于小品種作物，登記的殺菌劑較少，與其復雜的病蟲害發生狀況相比，可替代農藥種類偏少，且安全用藥技術欠缺，不合理用藥引起的楊梅殺菌劑殘留超標現象時有發生[8.9]。此外，楊梅為即食水果，沒有果皮，可食部分暴露于空氣中，再加上楊梅特殊的外表，很容易被農藥污染，且殘留不易清除；很多消費者習慣直接進食[]，增加了楊梅中殺菌劑殘留的膳食風險。

楊梅殺菌劑殘留不僅對消費者身體健康與環境安全造成危害，還是限制中國楊梅出口的技術壁壘。因此，業內學者非常關注楊梅中殺菌劑多殘留檢測方法的建立。張亮等和王天玉等分別建立了同時檢測楊梅中2種殺菌劑的高效液相色譜-串聯質譜法，前者檢出限均為 0.005mg/kg ，后者檢出限均為 0.010mg/kg 。平新亮等[13]和潘碧樞等[14]分別利用氣相色譜-質譜聯用法建立同時檢測楊梅中多種農藥的方法，前者可同時檢測5種殺菌劑，后者可同時檢測2種殺菌劑。Yang等[15]等和 Pan 等[16分別利用高效液相色譜-質譜法建立同時檢測楊梅中多種農藥的方法，前者可同時檢測7種殺菌劑，后者可同時檢測10種殺菌劑。上述色譜質譜聯用技術檢測楊梅中殺菌劑的方法雖然具有靈敏度高、準確性好的優點，但仍存在一些局限性。例如，上機檢測前，樣品處理步驟比較冗雜；儀器設備與相應耗材昂貴;需要專業技術人員進行操作[17-19]。因此，在政府監管和生產經營消費者自查等方面，色譜質譜聯用法仍不能滿足農產品即時檢測的需求。

為提升食品安全監管效能與檢驗效率，建立快速、簡便的農藥殘留快速檢測方法迫在眉睫。膠體金免疫層析法融合了有機合成化學、免疫學、膠體化學、物理學和材料學等多學科優勢，實現了復雜檢測原理與便捷操作的完美結合。該方法簡單快速，易于在農場和市場普及推廣，而且開發成功的產品準確性和特異性可滿足農藥殘留限量標準的要求[20]基于寧波市農產品質量檢測中心歷年楊梅農藥殘留監測數據，針對檢出頻次較高的多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇5種殺菌劑，分別開發符合限量要求的膠體金試紙條，并組裝成楊梅五聯殺菌劑速測卡。通過比較膠體金免疫層析法與超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）的檢出限、精密度及實際樣品檢測結果，驗證該技術的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅由寧波市農產品質量檢測中心提供，楊梅產地為寧波市慈溪市、余姚市等。

多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇完全抗原與單克隆抗體由中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所王靜教授課題組贈送。

40nm 單分散性金納米顆粒（南京基科生物科技有限公司）；檸檬酸三鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙晴（德國Merck公司）；QuEChERS鹽包（美國安捷倫公司）；N-丙基乙二胺（primarysec-ondaryamine，PSA）填料 40～63μm （北京安譜公司）；硝酸纖維素膜（美國Millipore公司）。

1.2 儀器與設備

BlueStarB型紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；噴膜機（杭州峰航科技有限公司）;AcquityXevo TQ-S型高效液相色譜-質譜聯用儀（配有電噴霧離子源及Masslynx數據處理系統，美國Waters公司）。

1.3 方法

1.3.1膠體金標記單克隆抗體采用分光光度法確定膠體金標記單克隆抗體的最適穩定量與最適pH^[21] 。將單克隆抗體在 0.005mol/L 的NaCl溶液中透析3次， 10000r/min 低溫離心 ^1h ，留上清液。參考Foubert等[22的方法，在固定蛋白含量的條件下，采用 K₂CO₃ 溶液調節膠體金溶液的 pH ，加人不同濃度的透析純化單克隆抗體，反應 15min 后分析金標抗體的穩定性。最適條件下制備的金標抗體用 1% 蔗糖和 1% BSA的Tris緩沖液溶解，備用。

1.3.2試紙條制備與組裝

1）硝酸纖維素膜的處理。選擇Millipore135硝酸纖維素膜進行檢測線（T線）與對照線（C線）的劃線[23.24]。檢測線上的抗原用碳酸鹽緩沖液（0.01mol/L.pH 9.6） 稀釋成 1mg/mL^[25] ，質控線上的羊抗兔 IgG 二抗用磷酸鹽緩沖液 （0.01mol/L.pH7.4）稀釋成 1mg/mL 。兩線相距 6mm ，并做標記。用劃膜儀將T線與C線樣品劃于硝酸纖維素膜上，37^°C 烘箱干燥 2h ，備用。

2）樣品墊處理。將樣品墊浸泡于 50mmol/L Tris-HCl（pH8.0），0.15mmol/LNaCl，0.25% 曲拉通的樣品墊處理液中， ^2h 后， 37^°C 烘箱干燥 ^2h ，備用[26]

3）金標結合墊處理。將金標結合墊置于含0.5%BSA，0.05% Triton X-100、5.0% 蔗糖的PB處理液中，均勻浸濕 1h，37^°C 干燥 3h 后，用噴膜儀將金標抗體按 0.01mL/cm 的量均勻噴涂在金標墊上，37^°C 干燥1h，備用[27]。

4試紙條組裝。用金標結合墊壓住硝酸纖維素膜，再粘貼樣品墊和吸水墊，如圖1所示。

圖1試紙條裝配示意圖

1.3.3 樣品前處理

1）UPLC-MS/MS法。稱取已去核并勻漿的楊梅空白樣品 5.00g 于離心管中，加入 20.0mL 乙腈，置于振蕩器中提取 30min ，加入QuEChERS鹽包劇烈振蕩 1min ，離心機 4^°C 下離心 3min 0 9500r/min） 。吸取 5mL 上清液，加入 100mg PSA和 200mg 無水硫酸鎂，漩渦振蕩 5min 后離心。吸 0.5mL 上清液至2mL 離心管中，加入 0.5mL0.1% 甲酸溶液，混合均勻， 0.22μm 濾膜過濾后待測。

2）免疫層析法。樣品提取液為添加 20% 甲醇溶液的 0.01mol/L 的PBS（ Φ_pH7.4） 。稱取已去核并勻漿的楊梅空白樣品 2.50g 于 5mL 樣品提取液中，漩渦振蕩 2min 后靜置 3min ，上清液為待測液。

1.3.4 檢測方法

1）UPLC-MS/MS法。質譜參數：離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應監測，電離電壓為 2.50kV ，霧化氣流速為 1000L/h 錐孔氣流速為 50L/h ，離子源溫度為 150^qC ，霧化溫度為 500^°C ，質譜參數如表1所示。液相參數：流動相A為 0.1% 甲酸溶液，流動相B為乙腈，色譜柱為AcquityUPLCBEHC18，柱溫為 35^°C ，樣品室溫度為 15^°C ，進樣量為 10μL ，液相參數和梯度洗脫程序如表2所示。

表1質譜參數

注：“*”為定量離子

表2液相參數和梯度洗脫程序

2）免疫層析法。將試紙條水平放置，用移液器吸取前處理中的上清液，滴入加樣孔中，反應8～10min。結果判讀：T線顯色，為陰性（未檢出）;T線不顯色，為陽性（有檢出）；T、C線均不顯色，為無效。

1.3.5 檢出限確認

1）UPLC-MS/MS法。以 0.1% 甲酸溶液與楊梅基質空白溶液按1：1體積比混合作為定容溶液，將多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇5種殺菌劑的混合標準溶液配制成 0.001，0.005 、0.010，0.050，0.100，0.500mg/kg 系列濃度標準溶液，繪制基質匹配標準曲線。

2）免疫層析法。選取楊梅空白樣品，分為5組，分別添加5種殺菌劑標準品至終濃度為0.01、0.05、0.20，1.00，5.00，25.00mg/kg ，同時設置空白對照。采用適配免疫層析技術的樣品前處理方法處理待測樣品，通過免疫層析檢測系統進行分析，確定該方法的檢出限（LOD）。

1.3.6精密度與準確度確認

1）UPLC-MS/MS法。用3個濃度梯度的添加回 收試驗確認UPLC-MS/MS方法的精密度與準確度， 每個濃度重復5次。5種殺菌劑的添加濃度均為 0.010、0.100、1.000mg/kg_o

2）免疫層析法。 ① 精密度確認。稱取60份楊梅空白樣品，每份的重量為 5.0g 。分為5組，每組12個樣品，3個樣品作為空白對照，另外9個樣品平行加入檢出限濃度的殺菌劑標準品。每組設置3個批次試紙條，每批次平行檢測3次，按照免疫層析檢出流程操作。 ② 準確度確認。根據《食品快速檢測方法評價技術規范》，采用假陰性率和假陽性率作為核心指標，評價快速檢測方法與標準儀器檢測法的一致性。在20份楊梅空白樣品中添加大于等于檢測限濃度的5種殺菌劑標準品作為陽性樣品，用于檢測假陰性率；另外準備20份楊梅空白樣品，用于檢測假陽性率，以此確認免疫層析法的相對準確度。

2 結果與分析

2.1殺菌劑特異性單克隆抗體被膠體金標記時的最適穩定濃度與最適pH

采用自測法初步檢測膠體金標記殺菌劑特異性單抗的最適宜濃度與 pH ，然后根據目測法的結果設計分光光度法的單抗濃度與 pH 檢測范圍，最終以分光光度法的結果為準。圖2展示了殺菌劑特異性單克隆抗體被膠體金標記時最適穩定濃度的目測法與分光光度法檢測結果（以多菌靈為例）。膠體金溶液 pH 均為8.5，單抗濃度分別為 0.10，25，50，100，200μg/mL 當單抗濃度低于 50μg/mL 時膠體金顏色不再改變，初步認為單抗的最適穩定濃度為 50μg/mL 。設計6.25?12.50?25.00?40.00?50.00?100.00?200.00μ_c^g/mL 濃度梯度進行分光光度法檢測，結果表明，單抗的最適穩定濃度為 50.00μg/mL 號

圖3展示了殺菌劑特異性單克隆抗體被膠體金標記時最適 pH 的目測法與分光光度法檢測結果（以多菌靈為例）。單抗濃度均為 50.00μg/mL ，膠體金溶液的 pH 分別為 5.5、6.5、7.5、8.5、9.0 ，當膠體金溶液 pH 低于8.5時膠體金顏色不再改變，初步認為最適 pH 為8.5。設計5個 pH 梯度（5.5、6.5、7.5、9.0）進行分光光度法檢測，結果表明，膠體金溶液的最適pH為7.5。8.5、

圖2膠體金標記多菌靈的最適穩定濃度

圖3膠體金標記多菌靈的最適pH

以分光光度法的膠體金最適 pH 為標記條件，通過分光光度法的單抗最適穩定濃度計算 120μL 體系中單抗實際用量，結果如表3所示， 120μL 體系中多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、戊唑醇的實際用量分別為 6.0，6.0，7.2，6.0，4.8μ_o^g 。

2.2UPLC-MS/MS法與免疫層析法檢測5種殺菌劑的檢出限結果

1）UPLC-MS/MS法。使用定容溶液（ 0.1% 甲酸溶液·楊梅基質空白溶液 =1：1 ，體積比）將多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇5種殺菌劑的混合標準溶液進行系列梯度稀釋，濃度分別為0.001?0.005?0.010?0.050?0.100?0.500mg/kg° 由圖4可知，5種殺菌劑濃度與對應峰面積均呈線性關系，相關系數 （r） 為 0.9994～0.9999，5 種殺菌劑的檢出限均為 0.001mg/kg 。

表3膠體金標記單抗的最適 pH 、最適穩定濃度和單抗實際用量

2）免疫層析法。在楊梅空白樣品中加入系列濃度的殺菌劑標準品，按照“1.3.3\"和\"1.3.4\"進行檢測，確定5種殺菌劑的檢出限，如表4所示。多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、戊唑醇的檢出限分別為 0.20，1.00，5.00，5.00，1.00mg/kg_o

2.3UPLC-MS/MS法與免疫層析法檢測5種殺菌劑準確度與精密度

1）UPLC-MS/MS法。由表5可知，UPLC-MS/MS法表現出良好的準確度與精密度，5種殺菌劑的平均回收率為 74.8%～107.5% ，相對標準偏差（RSD）為1.1%～9.0% 。5種殺菌劑在楊梅中的添加水平均為0.010～1.000mg/kg ，多菌靈的平均回收率為 89.3% 105.4% ，RSD為 2.9%～5.1% ;苯醚甲環唑的平均回收率為 91.4%～107.5% ， RSD 為 1.1%～2.1% ;吡唑醚菌酯的平均回收率為 89.5%～106.5% ， RSD 為 5.0%～ 9.0% ;嘧菌酯的平均回收率為 78.8%～91.7%，RSL 為2.5%.5.7% ;戊唑醇的平均回收率為 74.8%～78.9% ，RSD 為 2.1%1.4% 。楊梅中5種殺菌劑在 0.010mg/kg 添加水平時的總離子流如圖5所示。5種殺菌劑在楊梅中的添加水平為 0.010～1.000mg/kg 時，UPLC-MS/MS法的準確度與精密度均良好。

圖4UPLC-MS/MS法檢測5種殺菌劑的標準曲線

a.多菌靈；b.苯醚甲環唑;c.吡唑醚菌酯;d.嘧菌酯；e.戊唑醇

表4免疫層析法檢測楊梅中殺菌劑的檢出限

注：“-\"表示陰性；‘ ^?+ ”表示陽性。表6同

表5UPLC-MS/MS法測定楊梅中5種殺菌劑的添加回收率及相對標準偏差 n=5 1

圖5楊梅中5種殺菌劑在 0.010mg/kg 添加水平時的總離子流

2）免疫層析法。楊梅空白樣品中分別加入檢出限濃度的多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、戊唑醇5種殺菌劑標準品，檢測3個批次的試紙條，每個批次3個重復，結果（表6）表明，免疫層析法精密度良好。

表6免疫層析法檢測楊梅中5種殺菌劑的精密度 （n=3）

根據《食品快速檢測方法評價技術規范》，對楊梅樣品中多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇5種殺菌劑的免疫層析法檢測結果進行方法學評價，重點考察相對準確度、假陰性率及假陽性率。楊梅樣品共40份，其中陰性楊梅樣品20份，陽性楊梅樣品20份，結果如表7所示。5種殺菌劑的假陰性率均為0;多菌靈、苯醚甲環唑的假陽性率均為 5% ，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇的假陽性率均為0；多菌靈和苯醚甲環唑的相對準確度均為 97.5% ，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇的相對準確度均為 100% O

表7免疫層析法檢測5種殺菌劑的相對準確度、假陰性率及假陽性率

3小結與討論

選取楊梅種植中常用且殘留風險較高的5種殺菌劑（多菌靈、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、戊唑醇），分別建立超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法和膠體金免疫層析快速檢測法，通過靈敏度、準確度、精密度等關鍵指標的系統比對，評估2種方法的差異。2種方法檢出限對比結果顯示，UPLC-MS/MS法展現出更高的靈敏度，5種殺菌劑的檢出限均為 0.001mg/kg ；免疫層析法的檢出限分別為多菌靈 0.20mg/kg 、苯醚甲環唑 1.00mg/kg 、吡唑醚菌酯 5.00mg/kg 、嘧菌酯 5.00mg/kg 、戊唑醇1.00mg/kg 。根據GB2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》的規定，多菌靈、嘧菌酯和戊唑醇在楊梅中尚未制定最大殘留限量（MRL），草莓中多菌靈、嘧菌酯和戊唑醇的最大殘留限量分別為 0.5，10.0，2.0mg/kg ；而苯醚甲環唑和吡唑醚菌酯在楊梅中的最大殘留限量則分別規定為5.0，10.0mg/kg 。雖然免疫層析法的檢出限較高，但均小于最大殘留限量，完全適用于農藥殘留的定性篩查，能夠有效滿足農產品生產源頭自檢和居民居家自檢等現場快速檢測的需求。免疫層析法檢測農藥殘留的優點在于簡單、快速、靈敏且檢測產品攜帶方便，是現場即時篩查的理想手段[28-30]。免疫層析法可在 15min 內快速完成檢測，其方法學驗證結果顯示，5種殺菌劑的假陰性率為0，假陽性率 45% ，相對準確度 ?97.5% 。該方法展現出優異的篩查性能，完全滿足現場快速檢測的時效性和可靠性要求。

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（責任編輯雷霄飛）