深秋紅沙棘NHX1基因克隆與生物信息學分析

關鍵詞：深秋紅;沙棘（Hippophaerhamnoides）;HrNHX1基因;基因克隆;生物信息學分析

中圖分類號：S793.6 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）07-0192-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.033 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and bioinformatic analysis of NHXl gene in Shenqiuhong Hippophae rhamnoides

CUI Chang-zhena，HUO Yan-boab，ZHANG Si-yua，CHAI Guai-qianga.b，BAO Liang-liangb，DUAN Yi-zhong.b （a.College of AdvancedAgricultural Sciences；b.Yulin Genuine QinMedicinal Materials Research Institute，Yulin University， Yulin 719000，Shaanxi，China）

Abstract：UsingShenqiuhongHippophaehamnoidesastheexperimentalmaterial，thegeneencodingtheNHX1proteiof heNa+/H+ antiporter（NHX）familywascloned，andbioinformaticanalysis was performedonthe HippophaerhamnoidesNHX1protein（HrNHX1）.Theresults indicatedthatthefullengthofthe HrNHX1 gene wasapproximately6OObp，encodinganacidic hydrophobicpro tein consisting of 538 amino acid residues.The molecular formula of this protein was C₂₇₅₄H₄₂₆₉N₆₇₂O₇₅₉S₂₁ ，with a total of 8 502 atoms andarelativemolecular massof 59637.71.HrNHX1belonged toastableprotein，containing13transmembrane domains，ackinga signalpeptid，beingano-secretoryproteinndcontainingoneNa+/HexchangerdomaincharacteristicoftheNHXproteinfamily. Subcelularlocalizationanalysisshowedthatthe HNHX1proteinwaslocalizedonthevacuolarmembrane.Homologyalignmetanalysis indicated thattheHrNHX1proteinsequencehadhighsequencesimilaritywiththeNHX1proteinsequencesofGosypiumaimondi，Gossypiumhirsutum，Morusnotabilis，ndHeveabrasiliensis.PhylogenetictreeanalysisfoundthattheHrHX1proteinsequence clusteredonthesameevolutionarybranchwiththeNHXproteinsequencesofriceandwheat，whichhaddroughtresistanceandsalt tolerancefunctions，sugestingtheyhadacloseevolutionaryrelationship.The HrNHX1geneplayedanimportantroleinenhancing plantdroughtresistanceandsalttolerance，andregulatingtheactivityofitsencodedHrNHX1proteinorthexpresionlevelofthis gene could effectively improve plant adaptability to drought and salt stress.

Key words： shenqiuhong; Hippophae rhamnoides； HrNHXl gene;gene cloning；bioinformatic analysis

沙棘（Hippophaerhamnoides）屬于胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是一種具有顯著經濟價值和生態價值的植物[1]。在干旱的環境中，沙棘葉片細小且具有較厚的角質層和多表皮毛的特征，可有效減少水分蒸發，具有較好保水能力和抗旱性[2]。干旱阻礙植物的營養生長，使得植物的葉面積呈減小趨勢，從而影響其光合作用3；干旱還可以改變細胞結構，嚴重時會導致植物死亡。若植物生長過程中長期受土壤環境干旱脅迫，植物細胞會處于低滲透壓狀態[4]，進而影響植物生長發育。沙棘在處于適度干旱環境時能夠生存并長勢良好，這與其獨特的生理生化特性密切相關，即發達的根系能夠充分吸收土壤中的水分，同時根的形狀和結構也適應沙質土壤環境，能夠有效固定土壤，防止水土流失[5]。

首次在大麥中發現 Na⁺/H⁺ 逆向轉運蛋白基因（NHX）后，科學工作者陸續在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、玉米（Zea mays）、辣椒（Capsicum annu-um）大白菜（Brassica rapa ssp.Pekinensis）等植物中通過克隆得到NHX的同源基因，證實了NHX基因在植物界中廣泛存在。NHX作為 Na⁺/H⁺ 逆向轉運蛋白，在鹽脅迫條件下通過介導 Na⁺ 和 H⁺ 的跨膜運輸維持細胞質離子穩態，有效減輕鹽離子對細胞功能的損傷7；同時該蛋白還能調節水分跨膜運輸，維持細胞內水分平衡，從而增強植物對干旱脅迫的適應能力[8]。NHX基因在植物響應鹽堿脅迫時，利用質子泵和植物質子轉運蛋白的跨膜 H⁺ 電化學梯度作為驅動力，將細胞質中的 Na⁺ 逆向轉運至胞外或區隔化至液泡中，從而維持細胞質內低 Na⁺ 濃度狀態。這一過程不僅有效減輕 Na⁺ 的細胞毒性，還能調節細胞內 pH 穩態[9]。此外，NHX基因還可能影響細胞內物質含量，進而維持細胞膨壓達到抗旱的作用[10]。NHX基因在提升植物抗鹽性的同時，植物的抗旱能力也有所提升，AtNHX5基因過表達提高了桑樹的抗旱和耐鹽能力[]。ArNHX5基因或AtNHX6基因過表達的轉基因馬鈴薯耐鹽抗旱性顯著提高。在對 ZxNHX/VPI-I 轉基因小麥進行研究時發現，ZxNHX/VP1-1通過調節轉基因小麥 Na⁺ 和 K⁺ 在細胞中的分布，增加植物耐鹽性，并通過提升細胞內脯氨酸和可溶性糖等物質增加其抗旱性，在正常的鹽脅迫下小麥的葉綠素含量降低，但轉基因小麥的葉綠素含量比正常小麥高，也證明NHX可提高植物抗鹽能力[12]。

沙棘抗旱性研究大多聚焦在生理特性上，關于沙棘抗旱基因的研究較少，根據NHX基因在其他植物中發揮的作用，推測沙棘可能通過NHX基因高表達，提升細胞內離子濃度，從而升高滲透勢，致使植物組織吸水能力增強，最終增強其在干旱脅迫中的生存能力[13]。以深秋紅沙棘為研究對象，通過生物信息學分析沙棘NHX1蛋白（HrNHX1）的結構，并預測HrNHX1是否為抗旱基因，為植物抗逆性育種和分子生物學研究提供重要依據。

材料與方法

1.1材料

以內蒙古沙棘品種深秋紅為試驗材料，精選子粒飽滿、大小均一的種子100粒進行播種，最終發芽97粒，發芽率達 97% 。待幼苗株高為 15-20cm 時，采集健康葉片作為試驗樣品。

1.2沙棘的干旱處理及沙棘總RNA的提取

將種子用 KMnO₄ 消毒處理后以10顆種子為1組放置于濾紙上（每個培養皿中放置2張 11cm 的濾紙），用去離子水潤濕，將種子放置在恒溫培養箱中。待到其長出真葉時，移栽到 10cm （高） ?5cm （直徑）的育苗盤中，繼續在培養箱中育苗，溫度 20～ 28^°C ，出苗后每天澆1次水，待幼苗長至 15～20cm 時進行干旱脅迫處理。選取長勢旺盛，生長一致的沙棘幼苗。于2024年2月1日10：00停止供水，分別在停水后0、6、12、24、48、96h進行采樣。采集的沙棘葉立即放入液氮壺中，在 -80°C 的冰箱中儲存備用。RNA提取參照試劑盒說明書操作，首先將液氮速凍的沙棘葉片充分研磨成細粉后立即加入適量裂解液，經充分渦旋混勻后離心取上清液，該上清液通過CS過濾柱去除基因組DNA和蛋白質等雜質，隨后將濾液轉移至CR3吸附柱，依次使用RW1去蛋白液、DNaseI工作液和漂洗液進行柱上處理，最后用無RNase的去離子水洗脫獲得高純度RNA。RNA樣品通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測，并測定其濃度和純度。將RNA樣品分裝后保存于-80^qC 超低溫冰箱中備用。

1.3 PCR擴增與序列測序

根據PrimescriptTMII1st Strand Cdna Synthesis Kit說明書將RNA反轉錄成cDNA，取 5μL cDNA，加人20μL RNase Free ddH₂O 進行稀釋，在 0.2mL 的PCR管中，依次加人cDNA（ 1μL ） 、上下游引物（ 1μL ）、 ddH₂0 （ 10.5μL 等，定容至25μL ，混勻。

PCR擴增程序： 95^°C 預變性 3min;95^°C 變性 30s 56^°C 退火 30s，72°C 延伸 1min ，32個循環； 72^°C 延伸 5min 。PCR擴增產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物送至西安生工生物科技有限公司進行測序。

1.4 生物信息分析方法

利用EXPASY中的ProtParamtool分析蛋白的組成成分（氨基酸種類及數量）和理化性質（相對分子質量、等電點、穩定性、脂溶性、酸堿性、親水性/疏水性等），采用ProtScale工具分析蛋白質的親水性/疏水性特征，利用NCBI的CD-Search工具預測蛋白的保守結構域及蛋白結構的功能。通過Prabi在線工具進行二級結構預測，利用SWISS-MODEL構建蛋白三級結構模型;采用DeepTMHMM1.0在線工具預測跨膜結構域，通過SignalP4.1Server分析信號肽序列，同時結合WoLFPSORT進行亞細胞定位預測；運用NCBI數據庫和DNAman開展蛋白質序列同源性比對與分析，使用MEGA11.0.13軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 HrNHX1基因的克隆

將沙棘葉片的cDNA進行PCR擴增，PCR產物在約 1600bp 處有一條清晰且明顯的條帶（圖1），將擴增產物進行測序，得到 HrNHX 基因的核酸及氨基酸序列（圖2）。

2.2 HrNHX1蛋白的生物信息學分析

2.2.1HrNHX1蛋白的理化性質由表1可知，HrNHX1蛋白由538個氨基酸殘基構成，包含全部20種氨基酸，其中亮氨酸（Leu）占比最高，達 12.8% ，半胱氨酸（Cys）含量最低，僅占 1.1% 。HrNHX1蛋白含有42個帶負電的氨基酸殘基（ Asp+Glu 和38個帶正電的氨基酸殘基（ Arg+Lys ），其分子式為C₂₇₅₄H₄₂₆₉N₆₇₂O₇₅₉S₂₁ ，總原子數達8502個，相對分子質量為59637.71。由于等電點小于7.00，表明該蛋白為酸性蛋白。 ΔHrNHX1 蛋白為疏水性蛋白，親水系數為0.534；該蛋白在第483個氨基酸殘基處親水性最強，親水系數為-2.756，而在第63個氨基酸殘基處疏水性最強，親水系數為3.256（圖3）。HrNHX1蛋白的不穩定指數為38.90，不穩定指數小于40.00通常指示蛋白穩定性良好，因此判斷該蛋白為穩定蛋白。綜合考慮其疏水性和穩定性特征，推測該蛋白屬于穩定疏水性蛋白。HrNHX1蛋白的脂肪族指數為111.26，表明其具有較高的熱穩定性。

圖1HrNHX1基因的PCR擴增結果

表1HrNHX1蛋白的理化性質

圖3HrNHX1蛋白親水性預測

2.2.2HrNHX1蛋白結構及功能預測分析利用NCBI的CD-Search工具預測 HrNHX1 蛋白的保守結構域，結果如圖4所示。 HrNHX1 蛋白序列中第 50～ 442位氨基酸構成一個典型的 Na⁺/H⁺ exchanger結構域。該家族蛋白在植物抗逆性中發揮關鍵作用，通過調控細胞內 pH 和離子穩態來增強耐鹽性，同時調節細胞膨壓，進而提高植物的抗旱能力。

2.2.3HrNHX1蛋白的二級結構及三級結構分析利用Prabi在線工具對HrNHX1蛋白的二級結構進行預測。結果（表2）表明， HrNHX1 蛋白二級結構中∝ 螺旋占比最高，為 44.98% ，其次為無規卷曲和延伸鏈，占比分別為 32.90% / 17.84% ， β 轉角占比最少，為 4.28% 。利用SWISS-MODEL在線平臺構建了HrNHX1蛋白的三級結構模型（圖5）。

2.2.4HrNHX1蛋白跨膜結構域、信號肽及亞細胞定位分析選擇DeepTMHMM1.0在線工具對HrN-HX1蛋白的跨膜結構域進行預測分析，結果（圖6）表明，該蛋白具有13個跨膜結構域。利用SignalP

表2蛋白質二級結構占比

圖5HrNHX1蛋白三級結構預測

4.1Server對HrNHX1蛋白的信號肽進行分析（圖7），發現該蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白。通過WoLFPSORT在線工具預測HrNHX1蛋白的亞細胞定位，該蛋白定位于液泡膜，這與NHX基因的典型定位相符。

圖 6HrNHX1 跨膜結構域

圖7HrNHX1蛋白的信號肽預測

2.2.5HrNHX1蛋白序列同源性比對由圖8可知，HrNHX1蛋白序列與雷蒙德氏棉（Gossypiumraimon-dii）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）川桑（Morus nota-bilis）、橡膠樹（Heveabrasiliensis）NHX1蛋白序列的相似性為 76.69%～80.84% ，表明沙棘與其他植物NHX1蛋白序列顯示出較高的同源性。

2.2.6HrNHX1蛋白系統進化樹的建立利用MEGA11軟件中的Neighbor-Joining（NJ）方法，將HrNHX1蛋白與文獻報道有功能的水稻（Oryzasati-va）小麥（Triticumaestivum）桑樹（Morusnotabilis）、霸王（Zygophyllumxanthoxylum）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）大豆（Glycinemax）、豇豆（Vignaunguicu-lata）的NHX蛋白序列進行系統進化樹構建（圖9）。HrNHX1蛋白序列與水稻、小麥具有抗旱、耐鹽功能的NHX蛋白序列聚類于同一進化分支，表明它們在進化上具有較高的親緣關系，推測HrNHX1蛋白可能具有抗旱、耐鹽功能。桑樹、霸王、陸地棉、大豆和豇豆的NHX1蛋白序列并未與HrNHX1蛋白序列位于同一進化分支上，表明它們在進化上的親緣性較遠。

圖9沙棘與其他植物NHX蛋白序列的系統進化樹

3 小結與討論

NHX蛋白在維持細胞內的 pH 和 Na⁺ 的平衡方面起著重要作用，對維持細胞正常生理功能和整體穩態具有重要意義。在植物中，NHX蛋白通過可逆濃度梯度將細胞內的 Na⁺ 泵到細胞外或液泡內，從而維持細胞內離子平衡，這一功能對響應植物的非生物脅迫應答，尤其是對抗旱性和抗鹽性具有重要作用。提高植物中NHX基因的表達量不但可以提高植物對于鹽堿脅迫的耐受能力，而且可以提高植物的抗旱性[14]

通過與多種植物的NHX蛋白進行同源比對發現，HrNHX1蛋白序列與雷蒙德氏棉（Gossypiumrai-mondii）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）川桑（Morusnotabilis）橡膠樹（Heveabrasiliensis）NHX1蛋白序列具有較高的序列相似性。已有研究表明，在轉基因大豆中過表達TaNHX2基因可以提高脯氨酸和可溶性糖的含量，而這些滲透調節物質能夠增強細胞滲透壓，從而改善植株在干旱條件下的抗逆能力[15]由于 HrNHX1 與TaNHX2聚類于同一進化分支，因此推測它們可能具有類似功能，即通過維持細胞膨壓、調節滲透平衡來增強沙棘的抗旱性。在干旱和鹽脅迫下，OsNHX1基因過表達可以提高水稻植株的耐旱性和耐鹽性[16]。 NHX 基因在提高植物耐鹽性的同時也會提升植物的抗旱性，印證了HrNHX1基因具有抗旱能力。同時，通過對蛋白質二級結構的分析發現， HrNHX1 蛋白二級結構中 ∝ 螺旋占比最高，為 44.98% ，是其二級結構的主要組成形式，這一特征與其作為離子轉運蛋白的功能特性相符[17]。HrNHX1蛋白被預測為酸性且穩定的疏水性蛋白，其結構中含有13個跨膜區域，且不存在信號肽，為非分泌蛋白。亞細胞定位分析表明，該蛋白定位于液泡膜中。這些發現為探究HrNHX1蛋白的具體功能提供了重要理論依據。綜上，本研究結果將為深入探討HrNHX1基因在沙棘抗旱機制中的作用提供理論依據，同時為沙棘抗逆育種及分子生物學研究提供參考。

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（責任編輯雷霄飛）