勛西馬頭山羊線粒體DNAD-loop區遺傳多樣性分析

關鍵詞：鄖西馬頭山羊（Caprahircus）;線粒體DNA；D-loop區；遺傳多樣性

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）07-0198-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.034 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：口

Genetic diversity analysis of mitochondrial DNA D-loop region in Yunxi Matou goat

CHENGLei，LIUChen-hui’，CHENYang1，XIANGMin1，YUJie1，ZHONGZhu-xia1， XIAYong-chun2，YANGWu-jun3，HUXiu-zhong1

（1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，WuhanAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan43O65，China; 2.Yunxi Qingqing Matou Goat Breeding Cooperative，Shiyan 442624，Hubei， China; 3.Yunxi County Animal Husbandryand Veterinary Service Center，Shiyan 442624，Hubei，China）

Abstract：ThegeneticdiversityofYunxiMatougoat（Caprahircus）wasevaluatedbasedongeneticvariationanalysisofmitochondrial DNA（mtDNA）D-loopregionsequences.Thecomplete mtDNA D-loop sequences of 184 Yunxi Matou goats were obtained by PCR amplificationandsequencing，folowedbysystematicanalysisof nucleotidepolymorphismandhaplotypediversity，neutralitytests （Tajima’s D and Fu’s Fs ），mismatch distribution analysis，and cluster analysis with mtDNA D-loop sequences from different goat breeds.The results showed that the proportions of A， G ，C，and Tbases in mtDNA D-loop of Yunxi Matou goat were 30.77% ， 14.26%， 26.26% ，and 28.71% respectively，with A+T content （ 59.48% ）significantly higher than G+C content （ 40.52% ）.There were 52 haplotypesand131variable sites inmtDNAD-loopofYunxiMatougoat，ncluding51singleton variablesitesand80parsimonyinformative sites.Fu's Fs test showed Fs value of -2.48 ，indicating significant deviation from the neutral model（ Plt;0.05 ）.The phylogenetictreeofYunxi Matou goatandotherfivegoatbreeds（Chuandong White goat，Shannan White goat，Huanghuai goat，Beichuan Whitegoat，andBoergoat）showedthat184individuals weredividedintothreemajorbranches，ncluding twonativebranchesand oneBoergoathybridbranch.TheYunxi Matougoatpopulationshowedhighpolymorphismandrichgeneticdiversitywithgreatbreeding potential，but exhibited genetic introgression from surrounding local goat breeds and Boer goat.

Key Words：Yunxi Matou goat（Capra hircus）；mitochondrial DNA;D-loop region； genetic diversity

馬頭山羊是中國優良地方肉用山羊（Caprahircus）品種，主要分布于湖北、湖南等地，具有性成熟早、繁殖性能高、耐高溫高濕環境等特性[1]。由于缺乏科學的育種指導和系譜記錄不完善等原因，導致馬頭山羊品種退化、遺傳性能減弱等問題逐漸顯現，尤其是“重引進、輕選育\"的現象導致群體一致性差、生產質量下降、市場競爭力減弱，馬頭山羊的純種繁育及開發利用面臨新的挑戰。

哺乳動物線粒體DNA（MitochondrialDNA，mtD-NA）是由富含鳥嘌呤的重鏈和富含胞嘧啶的輕鏈共同構成的環狀DNA分子，其重組率低，常被認為是單核苷酸變異的儲存庫[2.3]。mtDNA D-loop 區是mtDNA上的非編碼區域，受到的選擇壓力小，其突變率高于編碼區域的突變率，且進化速度在整個線粒體基因組中最快，D-loop區多態性在家畜遺傳多樣性分析、起源進化和親緣關系鑒定等研究中具有重要應用價值4。E等5利用微衛星和mtDNA評估長江流域山羊的遺傳多樣性和種群結構;Vacca等[6]通過分析不同山羊品種mtDNAD-loop序列，在地中海山羊中發現了新的單倍型；Nguluma等分析了12個坦桑尼亞當地山羊種群mtDNAD-loop序列的遺傳多樣性、母系起源和系統發育關系。基于mtDNAD-loop序列的地方山羊品種遺傳多樣性分析已有報道，包括廣西都安山羊和隆林山羊[8]、山西太行黑山羊[]涼山會理黑山羊[]及馬鞍山白山羊[]等，但有關馬頭山羊遺傳特性、起源進化方面的研究較少。因此，通過測定mtDNAD-loop序列單核苷酸和單倍型多態性，分析馬頭山羊遺傳背景和親緣關系，對馬頭山羊品種的保護和利用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1材料

試驗樣品來自湖北勛西馬頭山羊養殖合作社，共184只健康馬頭山羊。用一次性真空采血管（含EDTA抗凝劑）頸靜脈采集試驗羊只血液樣品約5mL -20^°C 保存備用。

1.2 基因組DNA提取和PCR擴增片段測序

利用天根血液基因組DNA提取試劑盒從馬頭山羊全血中提取基因組DNA，參考韓浩園等[12]的研究結果設計馬頭山羊mtDNAD-loop序列PCR擴增引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。上游引物序列為 5^′ -AACCACTATTAACCACATCTA- 3^′ ，下游引物序列為 5^′ -CACTTACCATGTAAAAGACCC- ?3^′ 。PCR反應體系 （20μL） ：上、下游引物各 0.5μL，2×Taq PCRMaster Mix 10μL ，模板DNA 1μL ， ddH₂O （20 8μL 。PCR擴增程序： 95^°C 預變性 變性 30s

56^°C 退火 30s，72°C 延伸 60s，30 個循環； 72^°C 延伸 保存。反應完成后，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶長度與目的片段一致且亮度和純度符合要求的PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3 數據分析

利用Chromas2軟件查看測序結果峰圖，采用DNAMAN9.0軟件進行序列拼接，去除測序質量差的雜峰，采用BioEdit7.2軟件進行核苷酸序列組分分析，采用DNAsp5.10軟件統計鄖西馬頭山羊mtD-NAD-loop區多態位點數、核苷酸單倍型數、單倍型多樣性（Haplotypediversity，Hd）核苷酸多樣性（Nucle-otidediversity， π ）、平均核苷酸差異數（Averagenumberofnucleotidedifferences，k）、錯配分布Tajima’s D 和Fu's Fs 中性檢驗等。將mtDNAD-loop序列導入NETWORK10.2軟件構建單倍型網絡圖。從NCBI數據庫中下載波爾山羊、川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊5個山羊品種的mtDNA D-loop序列（表1），利用MEGA11軟件比對序列并分析遺傳關系，利用Kimura2-parameter模型計算品種間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種的系統發育樹。

表15個山羊品種名品種的mtDNAD-loop序列信息

2 結果與分析

2.1 mtDNAD-loop序列的PCR擴增結果

以184只勛西馬頭山羊基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增mtDNAD-loop序列， 1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產物條帶清晰明亮且無雜帶，擴增效果良好，擴增片段大小約 1200bp ，與預期目的片段大小吻合（圖1）。

2.2 mtDNAD-loop序列分析

對184只勛西馬頭山羊核昔酸多態性及mtDNAD-loop序列堿基組成進行分析，顯示A、G、 種堿基占比分別為 30.77%.14.26%.26.26% 、28.71%A+ T的占比為 59.48% ，明顯高于 G+C（40.52%） ，表明勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區富含A/T堿基，具有一定的偏倚性。共發現131個變異位點，占所測核昔酸的 11.62% ，其中包含51個單一多態位點，80個簡約信息位點（表2）。

圖1勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區PCR擴增產物

M：DL2000DNAMarker;1～20：鄖西馬頭山羊mtDNAD-loop序列的PCR產物

表2勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區核苷酸變異位點

序列高變區位置分析結果（圖2）顯示，鄖西馬頭山羊mtDNAD-loop序列堿基變異的分布有較大差異，區域 363～615bp 處變異概率較高，691～945 bp處變異概率較低。

2.3 勛西馬頭山羊群體歷史分析

對勛西馬頭山羊群體進行Tajima's D 和 Fu sFs 中性檢驗，Tajima's D 檢驗結果顯示， D 為-0.30，但差異不顯著（ （Pgt;0.10） ，Fu's Fs 檢驗結果顯示， Fs 為-2.48，差異顯著（ Plt;0.05 ），表明種群分化可能偏離中性突變理論模型。種群的錯配分布（圖3）顯示，勛西馬頭山羊群體具有超過2個峰的多峰錯配分布。

2.4mtDNAD-loop區單倍型分析

利用DNAsp5.10軟件對鄖西馬頭山羊mtDNAD-loop序列進行單倍型分析，共發現52種單倍型（表3）。其中，Hap-9個體數最多（16個），Hap-2（15個）和Hap-15（15個）次之。單倍型多樣性為0.957，核苷酸多樣性為0.020，平均核昔酸差異數為21.08。

圖2勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區核苷酸位置和核苷酸多樣性的關系

圖3勛西馬頭山羊種群錯配分布

表3勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區單倍型分布

單倍型網絡分析結果（圖4）顯示，試驗群體劃分為A單倍型組、B單倍型組、C單倍型組，其中A單倍型組包括12個單倍型，分別為 、Hap-13、Hap-15、Hap-17、Hap-27、Hap-30、Hap-31、Hap-33、Hap-36、Hap-44、Hap-46。B單倍型組包括13個單倍型，分別為 Hap-4，Hap-6，Hap-12 Hap-16、Hap-22、Hap-23、Hap-34、Hap-41、Hap-43、Hap-45、Hap-47、Hap-49、Hap-51。C單倍型組包括27個單倍型，分別為Hap-1、Hap-5、Hap-7、Hap-8、Hap-9、Hap-10、Hap-11、Hap-14、Hap-18、Hap-19、Hap-20、Hap-21、Hap-24、Hap-25、Hap-26、Hap-28、Hap-29、Hap-32、Hap-35、Hap-37、Hap-38、Hap-39、Hap-40、Hap-42、Hap-48、Hap-50、Hap-52。

圖4勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區單倍型網絡

綠色為A單倍型組；藍色為B單倍型組；紅色為C單倍型組

2.5 勛西馬頭山羊系統進化分析

勛西馬頭山羊與川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊4個山羊品種的地理分布如圖5所示。勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種（川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊、波爾山羊）的系統發育樹（圖6）顯示，184個個體被分為3個大分支，每個分支下個體與單倍型網絡相對應，其中A分支共包含58個個體，B分支包含41個個體，C分支包含85個個體。B分支存在4個亞支，其中3個亞支分別與黃淮山羊、陜南白山羊、川東白山羊聚為一支；C分支存在1個亞支，與北川白山羊聚為一支；A分支與B、C兩支遺傳距離較遠，與波爾山羊聚為一支。

3 小結與討論

通過mtDNAD-Loop序列多態性對勛西馬頭山羊遺傳多樣性以及遺傳背景進行探究，發現184只馬頭山羊mtDNAD-loop序列中 A+T 的占比為59.48% ， G+C 的占比為 40.52% ，A/T堿基占比明顯高于G/C，與姜雪鷗等[13]、王國華等[14]及黃興等[15]的研究結果一致，符合mtDNAD-loop區富含A/T堿基以及高變異序列特征，其主要原因是A/T堿基的富集可以快速促進RNA聚合酶等特異性分子的識別，有助于轉錄的完成[16。單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析結果顯示，鄖西馬頭山羊群體的 Hd 為0.957，高于黃勤華等[17]、Ling等[18]報道的湖南馬頭山羊 Hd （0.808和0.781），單倍型多樣性豐富。此外，序列中共發現131個變異位點和52種單倍型。鄖西馬頭山羊具有豐富的群體遺傳多樣性，育種潛能大。

圖5各山羊品種地理位置

CDW：川東白山羊；SNW：陜南白山羊；HHG：黃淮山羊； BCW：北川白山羊；MTG：鄖西馬頭山羊。下圖同

圖6勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種的系統發育樹

對勛西馬頭山羊群體進行中性檢驗，顯示 Fs 為-2.48，顯著偏離中性期望，表明種群可能經歷過擴增事件；多峰錯配分布表明，勛西馬頭山羊群體可能具有不同來源或與不同群體存在基因交流。構建勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種（川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊、波爾山羊）的系統發育樹，184個個體被分為3個大分支，分別為2個本地支與1個波爾山羊雜交支。2個本地支與黃淮山羊、陜南白山羊、川東白山羊、北川白山羊等地方品種存在一定親緣關系，與地理事實基本相符合，并且與楊心春等的研究結果一致，推測可能是勛西馬頭山羊過去長期實施半放牧半舍飼，甚至完全放牧的生產模式，與鄰近地區其他山羊品種發生了基因交流所致。波爾山羊雜交支與2個本地支遺傳距離較遠，與波爾山羊具有較近的親緣關系，可視為1個獨立分支，推測可能由于實際生產中部分養殖戶為改善經濟性狀將鄖西馬頭山羊與波爾山羊進行雜交所導致。研究結果表明，在長期的自然選擇和人工選擇下，勛西馬頭山羊可能與周邊多個地方山羊品種存在基因交流。

線粒體多態位點可以作為品種鑒定的輔助分子標記，而且將mtDNAD-loop區全序列作為DNA條形碼進行品種鑒定，在家禽中已經得到了廣泛應用[19.20]，但在家畜中相關研究才剛剛起步[21]。本研究通過錯配分布、單倍型網絡和系統發育樹3種方法相互驗證，結果高度一致，均顯示勛西馬頭山羊群體與不同山羊群體存在基因交流，且波爾山羊雜交支與其他支存在差異。研究結果表明，mtDNAD-loop序列可用于檢測鄖西馬頭山羊是否存在外來引進山羊品種的基因滲入。從形態學上分析，鄖西馬頭山羊與4個鄰近地區的地方品種川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊及外來引進品種波爾山羊的毛色均為白色，鄖西馬頭山羊相較于其他5個品種最大的區別為無角。在實際的選育過程中，大多數養殖戶主要根據表型特征進行選育，從而導致部分地方品種優良特性逐漸流失。通過綜合形態學特征和分子生物學差異分析為地方品種遺傳資源保護提供科學依據。

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（責任編輯雷霄飛）