高產油小球藻的超聲波誘變育種

中圖分類號：Q689;TS222 文獻標志碼：A 文章編號：1002-4026（2025）04-0078-08

Abstract：Toenhance the microalgae lipidcontent，Chlorela sp.wassubjectedtoutrasonic mutagenesis.Mutagenesis was performed for 20 minutes under conditions 40kHz 100W ，resulting in the cultivation 10 mutant strains （M1- M10）.Further screening ledtotheselection three stable high-lipid-producing strains，namelyM2，M5，M7.These strains were analyzed todetermine their biomass concentrationlipid，chlorophyll， protein massconcentration percentage.The results indicated that the biomass mass concentrations M2，M5， M7 were 0.384，0.379， 0.443g/L respectively. The lipid yields M2，M5， M7 were 14.70，13.34， 25.11mg/L ，respectively，all which were higher thanthat the wildtype（WT）strain，whichhadarecorded yield 9.38 mg/L.Comparedto the WT，the chlorophyllyield the mutant strains increased by 14.41% ， 3.01% ， 10.24% ，respectively，while the protein content the mutant strains increased by 7.30% ， 10.52% ， 13.66% ，respectively. This study is great significance to the industrialized production biodiesel.

Keywords ：Chlorella sp.；ultrasound；biomass；lipid；chlorophyll；protein

化石燃料的燃燒導致了嚴重的大氣污染、溫室效應等環境問題，對全球的可持續發展構成重大的挑戰[1]，尋找化石能源的替代品越發迫切[2-3]。由大豆、玉米、動物脂肪等有各類動植物油脂制備的生物柴油受到了廣泛關注[45]。與上述動植物原料相比，微藻具有生長速度快、油脂含量高、容易培養的優勢更易于生物柴油的生產[6-8]。因此加快微藻生物柴油的研究，對于清潔燃料的開發，減少化石燃料燃燒帶來的環境污染具有重要意義。

誘變育種具有突變率高、后代性狀穩定、育種周期短等優點，可以極大地提高新品種選育的速度[9]。微藻的誘變育種受到了國內外研究者的廣泛關注。韓飛[10]利用超聲方法將小球藻的油脂含量提升了 57% ;鄭立等[1]在超聲功率240W和超聲時間 30min 的條件下對小球藻進行誘變處理，誘變株的油脂產量提高了92.61% ;Sivaramakrishnan 等[12]利用紫外照射柵藻（Scenedesmus sp.），獲得的突變株中的油脂含量較 WT 提升了3倍; Jun 等[13]利用 ⁶⁰Co-γ 射線對小球藻進行誘變得到的突變藻株油脂含量提升了 54.9% 。雖然當前微藻誘變育種研究較多，但是以超聲波為誘變條件的研究較少[14]。超聲波具有操作簡便，經濟性、安全性高的優勢，且具有高穿透性，可以密封誘變，能夠有效減少雜菌污染的幾率[15]等優點。

本實驗擬通過超聲波誘變的方式篩選能夠穩定遺傳的高產油脂藻株，以提高產油小球藻的油脂含量，降低微藻生物柴油生產的成本。通過探究功率 $1 0 0 ～ ＼mathrm { ＼textW }$ 和頻率 40kHz 的超聲波條件下的最佳誘變時間，篩選出該條件下生長狀態良好的藻株。通過探究生物量、油脂產率等生理和生化指標篩選出適合微藻生物柴油生產的藻株，以期對提升微藻油脂產率以及生物柴油的規模化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器

X-5 型雙光束紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），XL5A型臺式離心機（湖南湘立科學儀器有限公司），WHL-65B型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器（日本三洋），KH-100DE型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司），JC-LDGZ-12S 型冷凍干燥機（青島聚創環保集團有限公司）。

1.1.2 主要試劑

二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、乙醇、氯仿，分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司。磷酸二氫鈉，分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。磷酸氫二鈉，分析純，購自天津市光復科技發展有限公司。考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（BSA），分析純，購自天根生化科技有限公司。

1.1.3 藻種及培養條件

本研究采用的藻株為野生型蛋白核小球藻（Chlorella sp.，WT）由新能源研究院分離保藏。藻種培養環境為：溫度 25^°C 、光照強度 6000lx 、光暗時間比 12h/12h 。接種培養基為BG11培養基，成分為EDTA- ?Na₂ 1 5mg/L、K₂HPO₄?3H₂O 222 mg/L、CuSO4 ·5H

1.2 實驗方法

1.2.1 突變時間和致死率測定

利用滅菌后的 0.1mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS）將生長到對數生長期的小球藻液的 680nm 光密度值0D₆₈₀ 調整為0.2，制成懸浮液。利用超聲波清洗器在 40kHz，100W 的條件下設置時間分別為0、5、10、15、20.25min 共6組，每組設置3個平行組對制得的懸浮液進行誘變。誘變完成后進行 24h 的暗培養，然后進行稀釋涂布平板，在1.1.3的條件下微藻生長7d后計算死亡率。根據死亡率在 80%～90% 為最適誘變條件，故選用致死率處在該范圍的誘變時間作為本實驗的誘變時間。所有實驗均在無菌條件下進行。致死率計算

公式如下：

式中， P_d 為致死率； Q₁ 為對照組平均藻細胞數; Q₂ 為實驗組平均藻細胞數

1.2.2 突變和藻株篩選

根據1.2.1得出的突變時間，將懸浮液分為3組，每組 200mL 進行超聲波誘變。利用1.1.3的條件對誘變完成的藻液進行培養和稀釋涂布。7d后挑選體積較大、顏色濃綠的藻株數株。保持生長環境不變依次進行96孔平板培養、試管培養和 100mL 錐形瓶培養，最后擴培至 5000mL 錐形瓶中。將其連續培養6代以后，測定油脂含量，篩選能夠穩定遺傳的藻株作為目標藻株。

1.2.3 生物量及細胞形態觀察

對篩選得到的小球藻株利用紫外可見分光光度計在 680nm 光密度（ OD₆₈₀ ）下測量細胞密度。按照李玉芹[16]等的方法利用冷凍干燥稱重法進行藻細胞生物量的測定。計算公式如下：

式中， ρ_DCW 為生物量， g/L;m₁ 為干燥后藻粉質量， g;V 為藻液體積， L

培養7d后利用熒光倒置顯微鏡觀察并記錄藻細胞形態

1.2.4 油脂產率及占比測定

取經冷凍干燥的藻粉 0.3g ，依據胡文軍[17采用的氯仿-甲醇提取方式稍加改進后對微藻中的油脂進行提取。計算油脂產率及占比，計算公式如下：

式中， R₁ 為油脂產率， mg/L;A₁ 為油脂占比， %;m₂ 為提取的油脂質量， mg 0

1.2.5 葉綠素質量濃度及占比測定

參考涂澤敏等[18]的方法采用分光光度計進行葉綠素的測定，公式如下 （5）～（7） ：

C_a+b=5.24（OD₆₆₄-OD₇₅₀）+22.24（OD₆₄₉-OD₇₅₀）

式中， C_a+b 為葉綠素總質量， mg;R₂ 為葉綠素質量濃度， mg/L;A₂ 為葉綠素占比 ，%;OD₆₄₉?OD₆₆₄?OD₇₅₀ 為 649、664，750nm 下的光密度值。

1.2.6 蛋白質質量濃度及占比測定

采用 Bradford 法測定[19]藻細胞中蛋白質質量濃度。根據標準曲線計算蛋白質質量濃度及占比。計算公式如下：

式中， R₃ 為蛋白質質量濃度， mg/L;A₃ 為蛋白質占比， %;m₃ 為提取蛋白質總量， mg

2 結果和討論

2.1 突變時間的確定以及突變藻株篩選

超聲誘變不同時期的死亡率如圖1所示，表明在 20min 時致死率為 85% ，在最佳致死率范圍內，選擇 20min 為誘變時間進行后面的實驗。經過誘變培養，篩選體積較大的10株（ M1～M10^? ）藻株進行擴大化培養。通過對誘變藻株的油脂提取測定和生長速度的測量，進一步篩選。結果分析表明（圖2、圖3）超聲波誘變后 M1、M3、M9、M10四組小球藻細胞濃度降低但油脂產率略有上升;M4組小球藻細胞濃度上升，油脂產率卻呈現下降趨勢;M6、M8兩組小球藻細胞濃度和油脂產率均呈現下降趨勢;經超聲波誘變后獲得了性狀不同的誘變株，M2、M5和M7細胞濃度和油脂產率均較高，對上述3組按照上文所述的培養條件進行擴增培養，并評估其形態結構、葉綠素、蛋白質、干重和脂質含量。

圖1超聲誘變不同時間的死亡率

圖2突變株和野生株（WT） 680nm 下的光密度值

Fig.2Optical density values mutant wild type（WT）strains at 680nm

注：圖中 表示各處理間的顯著差異程度 （plt;0.05） 。

2.2 誘變對藻細胞形態結構的影響

為了探究超聲波處理對細胞形態的影響，將獲得的3株藻細胞以藻液和培養液體積比2：8的比例接種于1000mL 的錐形瓶中，培養7d去除藻液后置于顯微鏡下觀察，結果如圖4所示。可以看出，超聲前后的微藻細胞在光學顯微鏡下無明顯區別。值得注意的是超聲后的細胞并沒有表現出破裂溶解狀態，培養基中并沒有出現細胞碎片。這表明低頻低強度超聲的作用仍能使微藻細胞保持完整性。有研究表明經低強度的超聲波處理后雖然對細胞整體結構沒有造成明顯破壞，但是細胞壁會出現了明顯的縫隙和微小孔洞[20]。說明低強度的超聲波處理可以改變細胞壁通透性，進而促進細胞與外界的物質交換。這些縫隙和微小孔洞導致了微藻細胞壁的通透性發生改變。超聲波處理后的這種改變可能加快了微藻與外界環境的物質交換，從而促進了微藻細胞的生長，然而，當縫隙數量過多或孔洞尺寸過大時，可能會導致微藻細胞死亡，其具體影響尚需進一步研究。

圖3突變株和野生株（WT）油脂產率

Fig.3Lipid mass concentration mutant wild type（WT） strains

2.3 超聲波處理對細胞生長速率的影響

為了評估超聲波處理對微藻的生長速度的影響，我們將WT和M2、M5、M7三株誘變株以 ^5L 的量按照前文的培養條件培養于錐形瓶中。每天從中抽取樣品用分光光度計測量細胞密度，為期 7d 。7d后收集藻細胞以測定其他指標。如圖5顯示，WT以及3株誘變株的生長周期均為7d，說明超聲波誘變未對小球藻生長周期產生明顯影響。其中1～2d為適應期，藻株生長速度較為緩慢，但在該時期M7的生長速度明顯高于WT、M2和M5;2～5d為對數生長期，藻株生長迅速，該時期M2、M5和M7已經展現出了明顯高于WT的生長能力;5～7d為穩定期，生長速率降低并逐漸趨于停滯。3株誘變株的生物量均高于WT，且WT的生長停滯現象更為明顯。該圖顯示3組突變株每天的 0D₆₈₀ 均高于WT，表明該條件下超聲波誘變對小球藻的生物質增長有積極影響。

圖5突變株和野生株（WT）光密度值

Fig.5Optical density values mutant wild type（WT） strains

2.4 超聲波處理對細胞干重和油脂的影響

細胞干重可以從宏觀上直接反映出小球藻的生長情況，是小球藻生長過程中的重要測定參數。比較4株藻株的生物量以及油脂含量有助于篩選出所需的目標藻株（表1），WT的細胞干重為 0.333g/L，M2，M5，M7 三株誘變株的細胞干重分別為 0.384，0.379，0.443g/L ，相較于WT分別提高 15.10% 、 13.70% 和 33.00% ，這表明在該條件下的超聲波誘變對微藻生物量的增長有積極影響。M7的干重最高，表明其對各類營養物質的利用效果更好。

微藻含油量是目前制約生物柴油產業化的關鍵限制性因素，加大微藻油脂含量，并有效提高微藻生物量，一直是國內外在“利用微藻生產生物柴油\"領域面對的關鍵性問題。在本研究中，WT中油脂產率和占比分別為 9.38mg/L 和 19.69% ，3 株誘變株中油脂產率和占比最高的均為 M7，分別為 25.11mg/L 和 35.62% ！M2和M5的油脂產率為 14.70，13.34mg/L ，油脂產率和占比同樣高于WT，這說明本條件下的超聲波誘變對于油脂含量的提升也有積極影響。3株突變株相較于WT分別提高了 56.89% .42.40% 和 140.67% ，提升效果顯著。

表1野生株（WT）及突變株的生物量、油脂產率及占比

Table 1Biomass lipid mass concentrations proportions in wild type（WT） mutant （M） strains

2.5 超聲波處理對微藻葉綠素的影響

為得出超聲波誘變對微藻的整體影響，又進一步研究了WT和M2、M5、M7中葉綠素的質量濃度和占比。葉綠素質量濃度和占比如圖6所示，M2、M5、M7三株誘變株的葉綠素質量濃度分別為3.35、3.02、3.23mg/L ，相較于對照組的 2.93mg/L 分別提高了 14.41%，3.01% 和 10.24% 。但是3株誘變株的葉綠素占比為 6.11%.5.58% 和 5.11% ，相較于對照組的 6.16% 略有降低，這與衛治金[21]的研究結果相似，他指出超聲波誘變導致微藻細胞中用于合成葉綠素的原料向合成油脂或其他生物質轉化，進而導致葉綠素質量比例的降低。由于生物量的提升，使3株誘變株的葉綠素質量占比雖有所降低，但微藻細胞中葉綠素質量濃度仍有一定程度的提升。葉綠素質量濃度的提升反映了微藻光合作用能力的增強，這也是超聲波處理后微藻各種生物質含量提升的直接原因，因此選擇葉綠素質量濃度高的藻株對高產油脂藻株的篩選具有積極意義。然而，目前關于超聲波處理對葉綠素組成影響的研究仍顯不足。對葉綠素組成的深入研究可能對高產油脂藻株的培育產生更為積極的促進作用。

圖6誘變株及野生株培養7d葉綠素質量濃度及占比的變化

Fig.6Changes in chlorophyllmassconcentration proportion in mutant wildtype（WT）strains 7days after cultur

2.6 超聲波處理對微藻蛋白質的影響

微藻中的蛋白質含量豐富，且具有較高的營養特性，能夠調節機體健康、預防和治療疾病等，在食品、醫藥、化妝品等領域具有廣闊的發展前景[22]，為此我們對WT和M2、M5、M7中的蛋白質的質量濃度進行了研究。采用考馬斯亮藍測定擬合曲線為： y=0.008 9x+0.019 9 9， R²=0.993 5 線性相關度擬合較好。圖7結果顯示M2、M5、M7三株誘變株的蛋白質質量濃度分別為 13.81，14.22，14.63mg/L，3 株誘變株的蛋白質質量濃度均高于WT的 12.87mg/L ，但是蛋白質在藻細胞中的占比卻為 25.17%.26.27% 和 23.11% 均低于WT的 27.05% ，并且油脂最高的M7株中蛋白質質量濃度最低，這也佐證了上文的猜測，即生物質合成原料更多地流向了合成油脂的方向，油脂低于WT的突變株其生物質合成原料可能流向了其他方向。蛋白質質量濃度的提高可能是超聲波處理促進了某些酶的合成，這些酶可能與油脂的合成有關，由于這些酶含量的提高，促進了微藻油脂的合成從而提高了油脂的產率。通過基因手段尋找該類基因，利用基因工程對該類基因的利用將會對微藻生物柴油的工業化生產有積極的推動作用。

圖7誘變株及野生株培養7d蛋白質質量濃度及占比的變化

Fig.7Changes in protein mass concentration proportion in mutant wild type（WT） strains after 7 days

3 討論與結果

在目前的研究中我們將野生型小球藻進行了超聲波誘變，獲得了M2、M5、M7三株優良的誘變株。這3株突變株的生物量、油脂、蛋白質以及葉綠素質量濃度均高于WT，其中M7生物量、油脂以及蛋白質質量濃度最高，其生物量為 0.443g/L ，是WT的1.33倍;油脂產率為 25.11mg/L ，是WT的2.68倍;蛋白質質量濃度為 14.63mg/L ，是WT的1.15倍。M2的葉綠素質量濃度最高為 7.26mg/L 。本研究獲得的油脂產率最高為M7的 25.11mg/L ，相比對照組提高 140.67% 。李青等[23]利用紫外線處理小球藻使油脂產率達到 2.4g/L ，比對照組提高 50% 。王[24]在常溫室壓等離子體誘變雙對柵藻將油脂含量提升了 97.05% ，可見本研究結果與其他相關研究相當甚至更高。綜上所述我們通過超聲波誘變獲得了適宜進行微藻生物柴油生產的藻株。

當前阻礙微藻生物柴油的因素主要有培養成本過高、提取技術不成熟以及缺乏優良的藻株。在培養以及提取技術方面主要存在著生產環境調控困難，嚴重影響大規模微藻培養以及培養成本和提取成本過高，經濟效益差等問題;在藻種選育方面，誘變育種已經成為篩選優良藻株的主要手段之一。但當前對于超聲波處理微藻后基因層次影響的研究較少，對超聲波處理后基因表達的研究不足，對提升微藻油脂產量以及微藻生物柴油應用產生了阻礙。為實現微藻生物柴油的產業化生產，應當進一步優化微藻培養技術和油脂提取工藝，提高微藻油脂生產效率，降低微藻生物柴油生產成本。在改進工藝的同時更應當加強對優良藻株的選育，在DNA以及RNA 領域的進一步探索可能會發現參與油脂生產以及生物量生產的新基因，這些新基因的發現將會成為研究定點誘變的良好目標，有助于通過基因編輯改良現有藻株，獲得更適合微藻生物柴油工業化的生產的優良藻株。

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