核盤菌熱休克蛋白HSP70的原核表達(dá)及抗體制備

中圖分類號(hào)：S435 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0488-5368（2025）08-0011-05

Prokaryotic Expression and Antibody Preparation of HSP70 in Sclerotinia sclerotiorum

Lu Ruihua，F(xiàn)ENG Zhao，YANG Daqun，DU Yutong，LIU Fang，SHI Jiafei， ZHAO Xi （CollegeofMedical Technology，ShaanxiUniversityofChinese Medicine，Xianyang，Shaanxi712O46，China）

Abstract： To investigate the prokaryotic expresson conditions of heat shock protein 7O （HSP70） in Sclerotinia sclerotiorum and to prepare its polyclonal antibody，the SsHSP7O gene was amplified by PCR and cloned into an expression vector.Expresion conditions were optimized，and the recombinant protein was purified.A polyclonal antibody was successully prepared，and itsspecificity and titer were evaluated. The results showed that when the induction temperature was increasedand the induction time was extended，the expression of SsHSP70 gradually increased，whereas IPTG concentration had litle effct.The optimal induction condition was 0.4 mmol/L IPTG at 37^°C for 6h . The optimal elution condition for purifying the recombinant protein using a Ni - NTA affinity chromatography column was 250 mmol/L imidazole.Western blot and ELISA results indicated that the antibody exhibited high sensitivityand specificity，with atiter reaching 1：51 2O0.In conclusion，SsHSP70 was successully expressed ina prokaryotic system，and ahigh-titer，high-specificitypolyclonal antibody was obtained，which can be used for further functional studies of HSP7O in S. sclerotiorum.

Key Words ：Sclerotinia sclerotiorum ; SsHSP7O； Prokaryotic expression; Polyclonal antibodies

引言

核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）是一種廣泛分布的植物病原菌，本研究的重點(diǎn)是探索核盤菌熱休克蛋白SsHSP70的表達(dá)條件，并制備其多克隆抗體。熱休克蛋白（heatshockprotein，HSP）是一類普遍存在于從原核生物和真核生物中，且在進(jìn)化上高度保守的蛋白，HSP一般在生物體內(nèi)有低水平的組成型表達(dá)，當(dāng)生物體受到外界不良環(huán)境（低溫、干旱、機(jī)械損傷等）刺激時(shí)，相關(guān)HSP的表達(dá)量會(huì)顯著提升，幫助生物體應(yīng)對(duì)不良環(huán)境[1]。在真菌中，HSP主要參與其發(fā)育及應(yīng)激環(huán)境下的耐受和耐藥性[2]。擬輪枝鐮孢（Fusariumverticillioides）和禾谷鐮孢（Fusariumgraminearum）均可響應(yīng)逆境溫度，從而提高HSP70 的表達(dá)量[3]，雙孢蘑菇（Agaricusbisporus）在熱脅迫過(guò)程中也可以通過(guò)啟動(dòng)不同的熱激蛋白基因表達(dá)來(lái)抵御高溫脅迫對(duì)菌絲造成的損傷[4]。除此之外，HSP還與植物致病真菌孢子的產(chǎn)生和致病力息息相關(guān)，例如分別敲除稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）熱激蛋白HSP40中編輯Ⅱ型和I型的基因MHF16和MHF21，病原菌產(chǎn)孢量均減少，但對(duì)分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成及致病性均無(wú)顯著影響，編碼HSP40蛋白的Mo-MHF6缺失也可導(dǎo)致M.oryzae菌絲生長(zhǎng)、無(wú)性產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)、子囊殼產(chǎn)生和附著胞形成等功能顯著下降[5]。這些結(jié)果均說(shuō)明，HSP70在菌核中的表達(dá)量為菌絲中的30倍之多，且高溫可誘導(dǎo)其大量表達(dá)[6。本研究通過(guò)在體外誘導(dǎo)重組菌株進(jìn)行表達(dá)，初步探究了核盤菌HSP70的表達(dá)條件，純化了核盤菌HSP70蛋白并制備多克隆抗體，以期為深入研究核盤菌HSP70蛋白的結(jié)構(gòu)及功能提供前期基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 材料與試劑

菌株：核盤菌（編號(hào)：CCTCCAF2021085）保存于本實(shí)驗(yàn)室。

試劑：PDA培養(yǎng)基購(gòu)自上海博微生物科技有限公司。pMDTM19-TVector、RNAisoPlus和反轉(zhuǎn)錄所用試劑均購(gòu)自TaKaRa，PCR所用試劑、感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a和BL21（DE3）、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindI均購(gòu)自TransGenBiotech，pET -28a （2 Ξ（Λ+Λ） 載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。核酸和蛋白電泳所用試劑，以及 Ni2+-NTA 親和純化柱子均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，Westernblot所用二抗和ECL染料均購(gòu)自博士德生物。新西蘭實(shí)驗(yàn)兔購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，弗氏佐劑購(gòu)自Sigma，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 HSP70原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

提取核盤菌菌核總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期提交的SsHSP70基因cD

NA序列（登錄號(hào)：OR148242）設(shè)計(jì)引物，上游引物序列 5^′ -CGGAATTCATGGCTCCAGCTATTGGTAT-3^′ （下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)），下游引物序列為 5^′ -CCCTCGAG TTAGTCAACCTCTTCGATCT -3^′ （下劃線為HindI酶切位點(diǎn)），以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增SsHSP70基因，連接至表達(dá)載體pET-28a （+） ，經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a（ （+） ）-SsHSP70，將其轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，PCR驗(yàn)證正確的重組細(xì)胞作為誘導(dǎo)菌株。

1.3核盤菌SsHSP70蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將1.2鑒定正確的陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0 .6左右，加入IPTG至終濃度為0.4 條件下誘導(dǎo)表達(dá) ^6h ，每小時(shí)取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。為了探究核盤菌SsHSP70重組蛋白的最適誘導(dǎo)溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度，在菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至 OD600=0.6～0.8 時(shí)分別設(shè)定不同誘導(dǎo)溫度（ 16、20、25、28、30 和37% ）和IPTG誘導(dǎo)終濃度 （0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0、1.2、1.4和 1.6mmol/L ）來(lái)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。

1.4核盤菌SsHSP70蛋白的純化

為了純化SsHSP70，收集 500mL 誘導(dǎo)所得菌液，由于SsHSP70以包涵體形式存在，低溫離心后在菌體中加入超聲波破碎緩沖液（ 20mmol/L Tris-HCl，50O mmol/L NaCl， 5mmol/L 咪唑， pH 7.8）進(jìn)行重懸，超聲破碎（ （on2s/off3s）3h ，高速離心后向沉淀中加入 8mol/L 的尿素， 4^°C 過(guò)夜溶解包涵體， ，4°C，13 000rpm 離心 20min 后收集上清液進(jìn)行梯度透析。

將離心所得上清液裝入透析袋中，低溫條件下依次用透析緩沖液（ （6，4，2，1mol/L 尿素）進(jìn)行透析，每個(gè)濃度梯度透析 ^12h 以上，SDS-PAGE檢測(cè)透析效果。為了得到純化的SsHSP70，采用Ni-NTA親和層析柱將透析后的蛋白液進(jìn)行分離純化，參照蛋白純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。分別用10、100、250mmol/L的咪唑洗脫液進(jìn)行沖洗，SDS-PAGE檢測(cè)洗脫效果。用純度為 55% 的重組蛋白作為抗原注射新西蘭兔，微量分光光度計(jì)檢測(cè)洗脫蛋白的濃度。將弗氏佐劑與重組蛋白進(jìn)行乳化后免疫新西蘭兔，皮下免疫 400ug/ 次，每2周免疫1次。共注射3次。

1.5 核盤菌SsHSP7O抗體特異性及ELISA效價(jià) 檢測(cè)

為了檢測(cè)抗體的特異性，以不同含量的SsH-SP70（5，2.5，1.6，1，0.5 和 0.3ng ）為樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育，清洗后用二抗孵育 ¹h ，顯色后在成像儀下面檢測(cè)結(jié)果。

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmu-nosorbentassay，ELISA）測(cè)定抗體效價(jià)，將抗原用包被緩沖液進(jìn)行稀釋，后經(jīng)洗滌、封閉、一抗和二抗孵育、顯色和終止，以 5% 脫脂奶粉作為空白對(duì)照，免疫前血清作為陰性對(duì)照，在 OD450nm 下進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒用EcoRI和HindⅢ進(jìn)行酶切，在近 2 000bp 處出現(xiàn)目的片段，其分子量大小與SsHSP70的 1890bp 基本一致（圖1），進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)序列的正確性。

圖1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1：重組質(zhì)粒雙酶切。

2.2重組載體的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 SP70轉(zhuǎn)化BL21（DE3），SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示， 28°C 下，IPTG可誘導(dǎo)菌株在 70～100kDa 間出現(xiàn)1條明顯蛋白條帶，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸增多（圖2），說(shuō)明SsHSP70誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖2重組菌株誘導(dǎo)不同時(shí)間蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；CK：空載對(duì)照； ：重組菌株誘導(dǎo)不同時(shí)間。

為探明最適誘導(dǎo)溫度和ITPG濃度與重組蛋白表達(dá)的關(guān)系，設(shè)置了不同溫度和不同IPTG濃度梯度，誘導(dǎo) 8h 。由圖3a可明顯看出，該重組蛋白在誘導(dǎo)溫度高于 25°C 的表達(dá)量明顯高于 16^°C 和20% ， 37% 誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)量最高。而不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)該蛋白的表達(dá)量影響不大（圖3b）。

圖3重組載體pET-28a （+ ）-SsHSP70轉(zhuǎn)化BL21菌株在不同溫度及誘導(dǎo)劑濃度下表達(dá)SDS－PAGE分析

a：不同溫度，b：不同IPTG濃度；M：Marker；CK：空載轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo) 8h 。

2.3 重組蛋白SsHSP70的純化

根據(jù)2.2中篩選的最佳誘導(dǎo)條件（溫度 37% ，IPTG使用濃度 0.4mmol/L ，誘導(dǎo) ）誘導(dǎo) 500mL 菌液。菌液經(jīng)高速離心收集菌體，加入裂解液，經(jīng)超聲波破碎后高速離心，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白存在于沉淀中，上清中無(wú)重組蛋白，說(shuō)明SsH-SP70以包涵體形式存在。采用不同濃度的尿素溶液進(jìn)行透析后經(jīng) Ni2+-NTA 親和層析柱分離純化，SDS－PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，用 10mmol/L 和100mmol/L 咪唑洗脫液只能洗脫少量目的蛋白（圖4，lane1和lane2）， 250mmol/L 咪唑洗脫液可洗脫大量的目的蛋白（圖4，lane3），但由于Ni2+-NTA 的吸附能力有限，在穿透液中也檢出了大量目的蛋白（圖4，lane4）。

因此，收集 250mmol/L 咪唑洗脫液洗脫的蛋白（濃度為 1.3mg/mL 用于制備多克隆抗體。

圖4SsHSP70的純化分析

M：Marker;1～3：10、100和 250mmol/L 咪唑洗脫液下的蛋白；4：經(jīng) 250mmol/L 咪唑洗脫 Ni2+-NTA 流出的穿透液。

2.4 抗SsHSP70多克隆抗體的Westernblot檢測(cè)

本試驗(yàn)共獲得抗SsHSP70多克隆抗體 11mL 純化后的抗體濃度為 0.5mg/mL 。為了檢測(cè)抗體的特異性，分別取不同含量的SsHSP70與制作的多克隆抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，由圖5可知，隨著SsHSP70總含量的減少，雜交條帶逐漸變暗，當(dāng)SsHSP70總量為 1ng （圖5，lane4），其與一抗結(jié)合效果也較靈敏，當(dāng)SsHSP70 總量為0.5和 0.3ng （圖5，lane5和lane6），也能檢測(cè)出特異性蛋白，這就表明制備的多克隆抗體特異性較強(qiáng)。

圖5Westernblotting檢測(cè)多克隆抗體與不同含量的SsHSP70蛋白和菌核總蛋白的特異性

M：Marker;1～6：不同含量SsHSP70蛋白（5、2.5、1.6、1、0.5和 0.3ng ），7～8：菌核總蛋白。

2.5抗SsHSP70多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照（ 5% 脫脂奶粉）和陰性對(duì)照（免疫前血清）都無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)，而抗原與不同稀釋比的抗體均有明顯陽(yáng)性反應(yīng)，且隨著抗體濃度降低，顏色逐漸減弱，0.25μg/mL 的抗原與1：51200稀釋的抗體孵育后吸光值大于0.1（圖6a），仍有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，且P/N值（陽(yáng)性血清與陰性血清吸光度比值）為2.2，大于2.1（圖6b），測(cè)得抗體效價(jià)為1：51200，以上表明制備的抗血清效價(jià)較高。

圖6SsHSP70抗體的ELISA效價(jià)檢測(cè)

3討論

HSP最開(kāi)始由Ritossa在研究果蠅熱應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，并由Tissieres等人鑒定分離[7]。后來(lái)利用RACE技術(shù)獲得的球孢白僵菌HSP70基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1971bp，其理論蛋白分子量為71.3 。本研究通過(guò)原核表達(dá)成功表達(dá)出SsHSP70蛋白，并探明了SsHSP70的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件，經(jīng)Westernblot檢測(cè)可見(jiàn)該蛋白分子量約 74.5kDa 分子量與球孢白僵菌HSP70較一致。

表達(dá)載體的選擇及誘導(dǎo)條件的控制與原核誘導(dǎo)表達(dá)的成功息息相關(guān)，本研究通過(guò)設(shè)置重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度來(lái)檢測(cè)SsHSP70的最適誘導(dǎo)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPTG的濃度對(duì)SsHSP70的表達(dá)量影響不大，但誘導(dǎo)溫度和SsHSP70的表達(dá)量息息相關(guān)，具體表現(xiàn)為當(dāng)誘導(dǎo)溫度為 37% 目的蛋白的表達(dá)量最高。從棉花中擴(kuò)增出來(lái)的Hsp70 最適表達(dá)溫度也為 37^°C ，但最適IPTG濃度為 0.2mmol/L^[9] ，而來(lái)源于水稻的Hsp70 蛋白的最佳表達(dá)條件為 30^°C 和 1.2mmol/L 的IPTG濃度[10]。這表明不同來(lái)源的Hsp70 最高表達(dá)量的誘導(dǎo)條件也有差異，可能與蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)，分子量大小等差異有關(guān)」，但大都為高溫誘導(dǎo)表達(dá)。

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)和Westernblot因具有高靈敏性和高特異性而廣泛用于免疫分析，本研究通過(guò)ELISA試驗(yàn)測(cè)得抗SsHSP70蛋白抗體效價(jià)為1：51200，免疫印記結(jié)果顯示，免疫沉淀復(fù)合物條帶單一清晰，當(dāng)SsHSP70總量為 0.3ng 時(shí)也能檢測(cè)出特異性蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗SsHSP70蛋白抗體的效價(jià)及特異性較好，該抗體可用于進(jìn)一步開(kāi)展SsHSP70蛋白功能及作用機(jī)制的研究。

熱休克蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制之一是通過(guò)溫度脅迫實(shí)現(xiàn)。溫度脅迫下，熱休克因子（HSF）與HSP70解聚，并以三聚體的形式與熱休克基因啟動(dòng)子中短的保守DNA元件一熱休克元件（HSE）結(jié)合，激活下游熱誘導(dǎo)基因表達(dá)[12]。SsHsp70 基因啟動(dòng)子中是否同樣存在HSE元件以及SsHSP70蛋白是否也可以對(duì)熱脅迫做出反應(yīng)將有待SsHSP70蛋白結(jié)構(gòu)的解析及功能探討。該抗體的成功制備為研究核盤菌對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具，未來(lái)可用于探討其在病害控制中的作用。

4結(jié)論

我們優(yōu)化了SsHSP70的表達(dá)條件，并成功純化該蛋白，制備了針對(duì)其的多克隆抗體，為后續(xù)的病原機(jī)制研究提供了新工具。

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