核盤菌熱休克蛋白HSP70的原核表達及抗體制備

中圖分類號：S435 文獻標識碼：A 文章編號：0488-5368（2025）08-0011-05

Prokaryotic Expression and Antibody Preparation of HSP70 in Sclerotinia sclerotiorum

Lu Ruihua，FENG Zhao，YANG Daqun，DU Yutong，LIU Fang，SHI Jiafei， ZHAO Xi （CollegeofMedical Technology，ShaanxiUniversityofChinese Medicine，Xianyang，Shaanxi712O46，China）

Abstract： To investigate the prokaryotic expresson conditions of heat shock protein 7O （HSP70） in Sclerotinia sclerotiorum and to prepare its polyclonal antibody，the SsHSP7O gene was amplified by PCR and cloned into an expression vector.Expresion conditions were optimized，and the recombinant protein was purified.A polyclonal antibody was successully prepared，and itsspecificity and titer were evaluated. The results showed that when the induction temperature was increasedand the induction time was extended，the expression of SsHSP70 gradually increased，whereas IPTG concentration had litle effct.The optimal induction condition was 0.4 mmol/L IPTG at 37^°C for 6h . The optimal elution condition for purifying the recombinant protein using a Ni - NTA affinity chromatography column was 250 mmol/L imidazole.Western blot and ELISA results indicated that the antibody exhibited high sensitivityand specificity，with atiter reaching 1：51 2O0.In conclusion，SsHSP70 was successully expressed ina prokaryotic system，and ahigh-titer，high-specificitypolyclonal antibody was obtained，which can be used for further functional studies of HSP7O in S. sclerotiorum.

Key Words ：Sclerotinia sclerotiorum ; SsHSP7O； Prokaryotic expression; Polyclonal antibodies

引言

核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）是一種廣泛分布的植物病原菌，本研究的重點是探索核盤菌熱休克蛋白SsHSP70的表達條件，并制備其多克隆抗體。熱休克蛋白（heatshockprotein，HSP）是一類普遍存在于從原核生物和真核生物中，且在進化上高度保守的蛋白，HSP一般在生物體內有低水平的組成型表達，當生物體受到外界不良環境（低溫、干旱、機械損傷等）刺激時，相關HSP的表達量會顯著提升，幫助生物體應對不良環境[1]。在真菌中，HSP主要參與其發育及應激環境下的耐受和耐藥性[2]。擬輪枝鐮孢（Fusariumverticillioides）和禾谷鐮孢（Fusariumgraminearum）均可響應逆境溫度，從而提高HSP70 的表達量[3]，雙孢蘑菇（Agaricusbisporus）在熱脅迫過程中也可以通過啟動不同的熱激蛋白基因表達來抵御高溫脅迫對菌絲造成的損傷[4]。除此之外，HSP還與植物致病真菌孢子的產生和致病力息息相關，例如分別敲除稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）熱激蛋白HSP40中編輯Ⅱ型和I型的基因MHF16和MHF21，病原菌產孢量均減少，但對分生孢子的萌發、附著胞的形成及致病性均無顯著影響，編碼HSP40蛋白的Mo-MHF6缺失也可導致M.oryzae菌絲生長、無性產孢、孢子萌發、子囊殼產生和附著胞形成等功能顯著下降[5]。這些結果均說明，HSP70在菌核中的表達量為菌絲中的30倍之多，且高溫可誘導其大量表達[6。本研究通過在體外誘導重組菌株進行表達，初步探究了核盤菌HSP70的表達條件，純化了核盤菌HSP70蛋白并制備多克隆抗體，以期為深入研究核盤菌HSP70蛋白的結構及功能提供前期基礎。

1材料和方法

1.1 材料與試劑

菌株：核盤菌（編號：CCTCCAF2021085）保存于本實驗室。

試劑：PDA培養基購自上海博微生物科技有限公司。pMDTM19-TVector、RNAisoPlus和反轉錄所用試劑均購自TaKaRa，PCR所用試劑、感受態細胞E.coliDH5a和BL21（DE3）、限制性核酸內切酶EcoRI和HindI均購自TransGenBiotech，pET -28a （2 Ξ（Λ+Λ） 載體為本實驗室保存。核酸和蛋白電泳所用試劑，以及 Ni2+-NTA 親和純化柱子均購自生工生物工程（上海）有限公司，Westernblot所用二抗和ECL染料均購自博士德生物。新西蘭實驗兔購自江蘇省農業科學院，弗氏佐劑購自Sigma，其它試劑均為國產分析純。

1.2 HSP70原核表達載體的構建及轉化

提取核盤菌菌核總RNA，反轉錄合成cDNA模板，依據本實驗室前期提交的SsHSP70基因cD

NA序列（登錄號：OR148242）設計引物，上游引物序列 5^′ -CGGAATTCATGGCTCCAGCTATTGGTAT-3^′ （下劃線為EcoRI酶切位點），下游引物序列為 5^′ -CCCTCGAG TTAGTCAACCTCTTCGATCT -3^′ （下劃線為HindI酶切位點），以反轉錄所得cDNA為模板進行PCR擴增SsHSP70基因，連接至表達載體pET-28a （+） ，經測序鑒定正確的重組質粒命名為pET-28a（ （+） ）-SsHSP70，將其轉化到E.coliBL21（DE3）感受態細胞中，PCR驗證正確的重組細胞作為誘導菌株。

1.3核盤菌SsHSP70蛋白的誘導表達

將1.2鑒定正確的陽性單克隆擴大培養至OD600=0 .6左右，加入IPTG至終濃度為0.4 條件下誘導表達 ^6h ，每小時取樣進行SDS-PAGE檢測。為了探究核盤菌SsHSP70重組蛋白的最適誘導溫度和IPTG誘導濃度，在菌液擴大培養至 OD600=0.6～0.8 時分別設定不同誘導溫度（ 16、20、25、28、30 和37% ）和IPTG誘導終濃度 （0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0、1.2、1.4和 1.6mmol/L ）來誘導目的基因表達。

1.4核盤菌SsHSP70蛋白的純化

為了純化SsHSP70，收集 500mL 誘導所得菌液，由于SsHSP70以包涵體形式存在，低溫離心后在菌體中加入超聲波破碎緩沖液（ 20mmol/L Tris-HCl，50O mmol/L NaCl， 5mmol/L 咪唑， pH 7.8）進行重懸，超聲破碎（ （on2s/off3s）3h ，高速離心后向沉淀中加入 8mol/L 的尿素， 4^°C 過夜溶解包涵體， ，4°C，13 000rpm 離心 20min 后收集上清液進行梯度透析。

將離心所得上清液裝入透析袋中，低溫條件下依次用透析緩沖液（ （6，4，2，1mol/L 尿素）進行透析，每個濃度梯度透析 ^12h 以上，SDS-PAGE檢測透析效果。為了得到純化的SsHSP70，采用Ni-NTA親和層析柱將透析后的蛋白液進行分離純化，參照蛋白純化試劑盒說明書進行操作。分別用10、100、250mmol/L的咪唑洗脫液進行沖洗，SDS-PAGE檢測洗脫效果。用純度為 55% 的重組蛋白作為抗原注射新西蘭兔，微量分光光度計檢測洗脫蛋白的濃度。將弗氏佐劑與重組蛋白進行乳化后免疫新西蘭兔，皮下免疫 400ug/ 次，每2周免疫1次。共注射3次。

1.5 核盤菌SsHSP7O抗體特異性及ELISA效價 檢測

為了檢測抗體的特異性，以不同含量的SsH-SP70（5，2.5，1.6，1，0.5 和 0.3ng ）為樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉、一抗孵育，清洗后用二抗孵育 ¹h ，顯色后在成像儀下面檢測結果。

通過酶聯免疫吸附試驗（enzymelinkedimmu-nosorbentassay，ELISA）測定抗體效價，將抗原用包被緩沖液進行稀釋，后經洗滌、封閉、一抗和二抗孵育、顯色和終止，以 5% 脫脂奶粉作為空白對照，免疫前血清作為陰性對照，在 OD450nm 下進行吸光度檢測。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建

對構建的重組質粒用EcoRI和HindⅢ進行酶切，在近 2 000bp 處出現目的片段，其分子量大小與SsHSP70的 1890bp 基本一致（圖1），進一步測序證實序列的正確性。

圖1重組質粒的雙酶切鑒定

M：DNA分子量標準物；1：重組質粒雙酶切。

2.2重組載體的誘導表達

將構建好的重組質粒 SP70轉化BL21（DE3），SDS-PAGE檢測結果顯示， 28°C 下，IPTG可誘導菌株在 70～100kDa 間出現1條明顯蛋白條帶，隨著誘導時間的增加表達量逐漸增多（圖2），說明SsHSP70誘導表達成功。

圖2重組菌株誘導不同時間蛋白表達SDS-PAGE分析

M：DNA分子量標準物；CK：空載對照； ：重組菌株誘導不同時間。

為探明最適誘導溫度和ITPG濃度與重組蛋白表達的關系，設置了不同溫度和不同IPTG濃度梯度，誘導 8h 。由圖3a可明顯看出，該重組蛋白在誘導溫度高于 25°C 的表達量明顯高于 16^°C 和20% ， 37% 誘導目的蛋白的表達量最高。而不同IPTG誘導濃度對該蛋白的表達量影響不大（圖3b）。

圖3重組載體pET-28a （+ ）-SsHSP70轉化BL21菌株在不同溫度及誘導劑濃度下表達SDS－PAGE分析

a：不同溫度，b：不同IPTG濃度；M：Marker；CK：空載轉化菌株誘導 8h 。

2.3 重組蛋白SsHSP70的純化

根據2.2中篩選的最佳誘導條件（溫度 37% ，IPTG使用濃度 0.4mmol/L ，誘導 ）誘導 500mL 菌液。菌液經高速離心收集菌體，加入裂解液，經超聲波破碎后高速離心，SDS-PAGE檢測發現蛋白存在于沉淀中，上清中無重組蛋白，說明SsH-SP70以包涵體形式存在。采用不同濃度的尿素溶液進行透析后經 Ni2+-NTA 親和層析柱分離純化，SDS－PAGE檢測結果顯示，用 10mmol/L 和100mmol/L 咪唑洗脫液只能洗脫少量目的蛋白（圖4，lane1和lane2）， 250mmol/L 咪唑洗脫液可洗脫大量的目的蛋白（圖4，lane3），但由于Ni2+-NTA 的吸附能力有限，在穿透液中也檢出了大量目的蛋白（圖4，lane4）。

因此，收集 250mmol/L 咪唑洗脫液洗脫的蛋白（濃度為 1.3mg/mL 用于制備多克隆抗體。

圖4SsHSP70的純化分析

M：Marker;1～3：10、100和 250mmol/L 咪唑洗脫液下的蛋白；4：經 250mmol/L 咪唑洗脫 Ni2+-NTA 流出的穿透液。

2.4 抗SsHSP70多克隆抗體的Westernblot檢測

本試驗共獲得抗SsHSP70多克隆抗體 11mL 純化后的抗體濃度為 0.5mg/mL 。為了檢測抗體的特異性，分別取不同含量的SsHSP70與制作的多克隆抗體進行Westernblot檢測，由圖5可知，隨著SsHSP70總含量的減少，雜交條帶逐漸變暗，當SsHSP70總量為 1ng （圖5，lane4），其與一抗結合效果也較靈敏，當SsHSP70 總量為0.5和 0.3ng （圖5，lane5和lane6），也能檢測出特異性蛋白，這就表明制備的多克隆抗體特異性較強。

圖5Westernblotting檢測多克隆抗體與不同含量的SsHSP70蛋白和菌核總蛋白的特異性

M：Marker;1～6：不同含量SsHSP70蛋白（5、2.5、1.6、1、0.5和 0.3ng ），7～8：菌核總蛋白。

2.5抗SsHSP70多克隆抗體的效價檢測

酶聯免疫吸附試驗檢測結果顯示，空白對照（ 5% 脫脂奶粉）和陰性對照（免疫前血清）都無陽性反應，而抗原與不同稀釋比的抗體均有明顯陽性反應，且隨著抗體濃度降低，顏色逐漸減弱，0.25μg/mL 的抗原與1：51200稀釋的抗體孵育后吸光值大于0.1（圖6a），仍有明顯的陽性反應，且P/N值（陽性血清與陰性血清吸光度比值）為2.2，大于2.1（圖6b），測得抗體效價為1：51200，以上表明制備的抗血清效價較高。

圖6SsHSP70抗體的ELISA效價檢測

3討論

HSP最開始由Ritossa在研究果蠅熱應激反應中發現，并由Tissieres等人鑒定分離[7]。后來利用RACE技術獲得的球孢白僵菌HSP70基因編碼區長度為1971bp，其理論蛋白分子量為71.3 。本研究通過原核表達成功表達出SsHSP70蛋白，并探明了SsHSP70的最適誘導表達條件，經Westernblot檢測可見該蛋白分子量約 74.5kDa 分子量與球孢白僵菌HSP70較一致。

表達載體的選擇及誘導條件的控制與原核誘導表達的成功息息相關，本研究通過設置重組蛋白表達的誘導溫度和IPTG濃度來檢測SsHSP70的最適誘導條件，結果發現IPTG的濃度對SsHSP70的表達量影響不大，但誘導溫度和SsHSP70的表達量息息相關，具體表現為當誘導溫度為 37% 目的蛋白的表達量最高。從棉花中擴增出來的Hsp70 最適表達溫度也為 37^°C ，但最適IPTG濃度為 0.2mmol/L^[9] ，而來源于水稻的Hsp70 蛋白的最佳表達條件為 30^°C 和 1.2mmol/L 的IPTG濃度[10]。這表明不同來源的Hsp70 最高表達量的誘導條件也有差異，可能與蛋白質自身結構，分子量大小等差異有關」，但大都為高溫誘導表達。

酶聯免疫分析技術和Westernblot因具有高靈敏性和高特異性而廣泛用于免疫分析，本研究通過ELISA試驗測得抗SsHSP70蛋白抗體效價為1：51200，免疫印記結果顯示，免疫沉淀復合物條帶單一清晰，當SsHSP70總量為 0.3ng 時也能檢測出特異性蛋白，實驗結果表明抗SsHSP70蛋白抗體的效價及特異性較好，該抗體可用于進一步開展SsHSP70蛋白功能及作用機制的研究。

熱休克蛋白的誘導表達機制之一是通過溫度脅迫實現。溫度脅迫下，熱休克因子（HSF）與HSP70解聚，并以三聚體的形式與熱休克基因啟動子中短的保守DNA元件一熱休克元件（HSE）結合，激活下游熱誘導基因表達[12]。SsHsp70 基因啟動子中是否同樣存在HSE元件以及SsHSP70蛋白是否也可以對熱脅迫做出反應將有待SsHSP70蛋白結構的解析及功能探討。該抗體的成功制備為研究核盤菌對環境脅迫的應答機制提供了強有力的工具，未來可用于探討其在病害控制中的作用。

4結論

我們優化了SsHSP70的表達條件，并成功純化該蛋白，制備了針對其的多克隆抗體，為后續的病原機制研究提供了新工具。

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