云南尋甸縣白及葉斑病病原菌的分離與鑒定

中圖分類號：S435.672 文獻識別碼：A 文獻編號：1005-6114（2025）05-013-05

白及（Bletillastriata）是蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla）多年生草本植物[1]，其塊莖含有豐富的醇類、醌類和多糖等化合物，具有止血、抗腫瘤、抗菌和提高免疫等藥理作用[2]。白及最早記錄于《神農本草經》，因其較高的藥用價值而在中國、日本、韓國等地廣泛種植2；此外，白及作為蘭科植物，花色多彩、形態端莊，加之其生長適應性強，在園林景觀布景和室內盆栽布置中廣受歡迎，具有很高的觀賞價值[3]

鑒于白及極高的藥用價值和觀賞價值，近年來其需求量不斷增加。但隨著種植規模不斷擴大，白及病害發生程度也逐年加重[4]，成為制約白及產業健康發展的重要因素之一。已報道危害白及葉片的病原菌種類眾多，例如，銹病病菌（Coleosporiumbletiae）可導致葉片出現淡黃色褪綠病斑，嚴重時葉片扭曲甚至脫落[4]；里斯彎孢菌（Curvularia resi）侵染白及葉片產生褐色圓形或橢圓形病斑，葉緣、葉尖枯死，嚴重時導致整株枯萎死亡[5]；黑輪層炭殼菌（Daldiniaconsentrica）引發白及葉片喪失養分和水分，從而形成類似火燒的黑色輪層；侯秀明報道炭疽菌（Colletotrichumorchidophilum）危害白及葉片，形成不規則的深褐色大病斑，繼而整個葉片枯萎[7]；鏈格孢菌（Alternariaalternata）、小新殼梭孢屬真菌（Neofusicoccumparvum）及間座殼屬真菌（Diaphorthe sackyae，D. phaseolorum，D. ceridiyae）均可危害白及葉片形成黑色病斑，嚴重時可致葉片枯萎[7]。

2022年在云南省市尋甸縣白及種植基地出現了一種新的白及葉部病害，葉片表面呈黃褐色橢圓形或不規則形狀病斑，病斑周圍顏色逐漸加深并形成棕褐色暈圈，嚴重時葉緣處呈深褐色，病斑面積擴大甚至枯萎。為明確引起該病害的病原菌種類，本研究從發病的白及葉片中分離菌株，并結合形態學特征、分子生物學特征及致病性測定等多方面進行鑒定，最終明確其分類地位，以期為白及病害研究及綜合防控提供理論依據，

材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2022年于云南省市尋甸縣白及種植基地采集疑似炭墊菌引起的白及葉斑病樣品10份，觀察并記錄病害癥狀特征

1.1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200g，瓊脂 15g ，葡萄糖 20g，ddH₂O 定容至 1L，121^°C 高溫高壓滅菌 20min ，倒出備用[8]

1.1.3 供試試劑

Biomed Fungi Genomic DNA Extraction Kit 試劑盒（北京博邁德基因技術有限公司）； 2× power TaqPCRmasterMix（北京擎科生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化

采用組織分離法對病原菌進行分離。將病組織置于 75% 的酒精中消毒處理 1min ，滅菌水清洗2～3次，充分晾干并接種于PDA培養基上， 28^°C 黑暗培養3～5d，待其長出菌落后進行分離純化，并進一步采用單孢分離法獲得純培養物， 4% 冰箱保存，備用[7，8]

1.2.2 形態學觀測

將分離物接種于PDA培養基，恒溫 28^°C 培養7d后觀察菌落形態和顏色等特征，采用十字交叉法測量菌落直徑并計算菌落生長速率；隨后在培養基中加入適量滅菌水洗脫菌絲體和孢子，3層紗布過濾，借助光學顯微鏡觀察分生孢子的形態特征，并測量統計其長和寬[8]

1.2.3 致病性測定

選取3株健康的1年生白及植株進行柯赫氏法則驗證。將代表性菌株（編號BJ-01和BJ-02）培養7d，然后用直徑 6mm 的無菌打孔器取菌落邊緣生長旺盛區域的菌絲塊，接種于創傷的白及葉片，使得菌絲與傷口完全貼合，置于 28^°C 培養間保濕培養，定期觀察并記錄發病情況。對照組接種無菌PDA培養基。待接種葉片發病后，觀察是否與田間病害癥狀一致，并進一步從發病部位重新分離病原菌，采用1.2.1和1.2.2的方法鑒定是否與接種菌株一致，完成柯赫氏法則驗證[9]。試驗進行3次生物學重復。

1.2.4 分子鑒定

將病原菌置于PDA培養基 28^°C 培養7d后收集菌絲，采用Biomed FungiGenomic DNA ExtractionKit試劑盒提取菌株基因組DNA，利用ITS、ACT及RPB2基因的引物（表1）進行PCR擴增

PCR反應體系為 25μL ：模板DNA 4μL （150ng/μL ）， 2× power Taq PCR masterMix 12.5μL ，上、下游引物各 1μL（ 10μmol/L）. ddH₂O 補足至25μL 。以 ddH₂O 替代模板DNA作為陰性對照。

PCR擴增反應程序為： 98°C 預變性 2min ：98^°C 變性 10s ，退火溫度和 72°C 延伸時間見表1，35次循環； 72^°C 延伸 2min;4^°C 保存。

所得PCR原液送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，將測得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行BLAST比對分析，下載GenBank數據庫中與其同源性較高的菌株核苷酸序列，將各菌株序列按照ITS-ACT-RPB2的順序進行串聯，借助MEGA11.0軟件，采用最小進化法（Mini-mumEvolution，ME）法構建系統發育樹，bootstrap設定為1000[8.9]

表1引物信息

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

葉片感染初期，表面出現褐色橢圓形或不規則形狀病斑，葉斑周圍顏色逐漸加深為棕褐色；隨著病情加重，褐色病斑逐漸擴大，外圍顏色變為黑褐色直至壞死，嚴重時整株葉片枯死（圖1）。

A：健康葉片；B：葉斑病癥狀圖1白及葉片田間觀察

2.2 病原菌形態學鑒定

采用組織分離法和單孢分離法進行病原物的分離純化，共計獲得10株形態學特征表現一致的分離物。從中選取2株代表性菌株BJ-01和BJ-02進行形態學特征觀測。菌株培養7d后，菌落正面呈灰白色，菌絲呈棉花狀松軟質地，邊緣為不規則形狀；菌落背面中心為淡黃色，邊緣呈黃白色（圖2-A、B）。分生孢子近圓形，透明，無隔，壁光滑，有的單個分開，有的粘連在一起，大小為 （6.54～7.96）μm×（5.42～ 6.45）μm （平均 7.25μm×5.94μm n=50 ）（圖2-C）。與Pi等報道的擴散炭墊菌形態特征相似[1]，初步判定本研究獲得的分離物為擴散炭墊菌。

2.3 病原菌致病性測定

健康的白及葉片接種分離物4d后，所有葉片的接種位點均出現黃色針尖大小的病斑，外圍有黃褐色輪狀暈圈；隨后病斑逐漸擴大，外圍由黃褐色變為棕褐色；接種10d后，病斑外圍呈棕褐色至黑褐色，病斑中央葉片變薄、顏色變淺，病斑長度為0.9～1.2cm （圖3-B、C），供試菌株接種后表現癥狀與田間癥狀相似。對照組無病癥出現（圖3-A）；同時，將接種分離物發病后的葉片進行病原菌再分離，獲得的菌株形態特征和分子生物學特征均與接種菌株相同。據此，確定引起云南尋甸白及葉斑病的病原菌為擴散炭墊菌。

A～B：菌落形態；C：分生孢子形態 圖2白及病原菌的形態學特征

A：空白對照;B：BJ-01的致病性；C：BJ-02的致病性圖3白及葉片病原菌感染的致病性

2.4病原菌多基因系統發育

擴增并測序獲得10個分離物的ITS、ACT及RPB2基因序列，將所得序列在NCBI數據庫中BLAST比對顯示，所有分離物的ITS基因序列與MN540696.1、AB625422.1的一致性為 100% ，與MN341796.1的一致性為 99.82% ACT 基因序列與GQ389692.1、KU684087.1、MH397723.1的一致性均高于 95% ；RPB2基因序列與GQ844769.1、MT512901.1、MT512899.1的一致性均高于 95% 。選擇代表性菌株BJ-01和BJ-02 進行分子生物學鑒定，并將序列提交至GeneBank數據庫，登錄號依次為：OR835293（ITS）、OR838795（ACT）、OR838797（RBP2）和OR835294（ITS）、OR838796（ACT）、OR838798（RBP2）。將3個基因（ITS-ACT-RPB2）

拼接序列與參考菌株序列（表2）進行比對分析并構建系統發育樹。結果顯示，菌株BJ-01和BJ-02與擴散炭墊菌聚為一支，支持率為 100% （圖4），表明

BJ-01和BJ-02與擴散炭墊菌的親緣關系最近，為同一種。綜合形態學鑒定和多基因系統發育分析結果，將分離物確定為擴散炭墊菌。

表2用于構建系統發育樹的菌株和基因序列

圖4基于ITS-RPB2-ACT多基因序列聯合構建的ME系統發育樹

鄰接法分析的bootstrap 值標注于系統發育樹的節點處，膠孢炭疽菌（CGM4378）設置為系統發育樹的外群。

3討論

近年來，由于白及潛在的藥用價值和觀賞價值的不斷發掘，被廣泛種植于云南、貴州、四川等多個省份，主栽品種包括白及（B.striata）、華白及（Bsinensis）黃花白及（B.ochracea）小白及（B.formosana）[6]。然而，隨著栽培面積擴大、栽培模式多樣化，導致病原菌種類復雜多樣、病害發生程度也日趨嚴重，鞘銹菌屬（Coleosporium sp.）[4]、彎孢屬（Curvularia sp.）[5]、間座殼屬（Diaphorthe sp.）[8]、鏈格孢屬（Alternariasp.）[8]等多屬的真菌均能侵染白及葉片，造成病害發生，但尚未見有關白及葉斑病相關報道。本研究通過病原菌的分離純化，結合形態學、多基因系統發育樹分析和致病性測定進一步鑒定，將云南尋甸縣新出現的一種白及葉斑病病原菌鑒定為擴散炭墊菌。

目前，炭墊菌屬真菌多發現于腐壞的植物上[0]或作為內生菌被報道[]。Pi等在云南、海南和貴州的腐木上分離鑒定到炭層菌（Nemania）的6個新種[12];炭層菌屬（Nemania sp.）作為內生菌在地衣上被分離發現[0]；而部分內生菌可在宿主中潛伏，進而引起植物發病，即植物與內生菌之間存在互相拮抗，一旦平衡被打破，或宿主處于不利的環境中時，內生真菌便使植物表現出病癥[]。Xue 等通過形態學和分子生物學鑒定發現雙乳突炭層菌（Nemaniabipapillata）可導致貴州茶樹葉片產生葉斑病[13]；周婕分離鑒定到1000多株病原菌可對紫荊澤蘭產生致病性，其中炭層菌屬占 8.53% ，屬于優勢致病屬[14]。2019 年，鄧文祥等采用形態學和 ITSrDNA分子系統發育分析相結合的方法，在白及根部分離到炭墊菌屬真菌[15]；然而，其是否對白及葉片具有危害尚未報道。本研究在云南尋甸縣白及葉部病樣中分離到擴散炭墊菌，并經柯赫氏法則驗證確認其為白及葉斑病病原菌，推測白及根部及根際土壤可能是炭層菌越冬的場所，當環境條件適宜時，根部的炭層菌也可能引起白及葉斑病的發生。

參考文獻

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