真菌誘導(dǎo)子對(duì)南方紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)及紫杉醇合成的影響

徐志榮+趙英杰+王婷+魏賽金

摘要：用真菌誘導(dǎo)子處理南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairer）懸浮細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)、紫杉醇含量及其細(xì)胞酶活的變化，初步探討真菌誘導(dǎo)子對(duì)南方紅豆杉懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第8天加入100 μg/mL真菌誘導(dǎo)子，可明顯增加懸浮細(xì)胞的生物量，紫杉醇的含量也有提高；添加真菌誘導(dǎo)子能抑制細(xì)胞多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairer）；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；真菌誘導(dǎo)子；紫杉醇

中圖分類號(hào)：S791.49；Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3283-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.024

Effects of Fungus Elicitor on the Cells Growth and Paclitaxel Accumulation of

Taxus chinensis var. mairer

XU Zhi-rong， ZHAO Ying-jie， WANG Ting， WEI Sai-jin

（College of Biological Science and Engineering/Jiangxi Agricultural Microbial Resource Development and Utilization Engineering Lab，

Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Abstract： Taxus chinensis var. mairer suspension cells were treated with fungal elicitor. The effects of fungal elicitors on the growth of T. chinensis var. mairer suspension cells were studied to measure the changes of cell growth index， paclitaxel content and enzyme activity. The results showed that， when the elicitors were added into the cell cultures at the 8th day， 100 μg/mL fungus elicitor had promoted on the cell growth and the synthesis of paclitaxel； The addition of fungus elicitor promoter inhibited the activity of polyphenol oxidase（PPO） and phenylalanine ammonia（PAL）， and it is good for cell growth.

Key words： Taxus chinensis var. mairer； cell suspension cultures； fungus elicitor； paclitaxel

南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairer）又稱紫杉，為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物，是紅豆杉的1個(gè)變種，主要分布于中國(guó)南方地區(qū)，其樹(shù)皮中含有紫杉醇[1]。紫杉醇是紅豆杉屬植物的次生代謝產(chǎn)物，是一種對(duì)治療肺癌、卵巢癌等有特效的抗癌藥物[2]。目前紫杉醇主要來(lái)源是從紅豆杉屬植物的樹(shù)皮、根部中提取，含量極低，且紅豆杉屬植物生長(zhǎng)速度緩慢，以致于紫杉醇的消費(fèi)每年都是需大于供[3]。為了擴(kuò)大來(lái)源以滿足市場(chǎng)需求，人們對(duì)紅豆杉屬植物愈傷組織細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了深入的研究，尤其對(duì)外植體的選擇、培養(yǎng)基的組成等做了大量的優(yōu)化研究，以此來(lái)提高紫杉醇含量[4]。雖然進(jìn)行了大量的研究試驗(yàn)，但仍未解決其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求。因此，探究一種新的方式以提高紫杉醇的產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

真菌誘導(dǎo)子是誘導(dǎo)植物細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的一類物質(zhì)，包括真菌菌體、菌液濃縮物和菌液提取物、菌絲體高溫處理后的可溶性成分、細(xì)胞壁降解成分、蛋白質(zhì)和肽類等[5]。藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)中，真菌誘導(dǎo)子被識(shí)別后，在植物與真菌的相互作用中通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起植物基因表達(dá)發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)酶的活性，最終刺激植物發(fā)生防御反應(yīng)，誘導(dǎo)特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累，從而提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，這種方法被廣泛用于促進(jìn)各種紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的合成[6，7]。為此，本研究通過(guò)在不同時(shí)間添加不同濃度真菌誘導(dǎo)子，發(fā)現(xiàn)適宜濃度真菌誘導(dǎo)子可以有效地促進(jìn)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，合成紫杉醇，這一結(jié)果可為南方紅豆杉細(xì)胞高產(chǎn)紫杉醇的研究和利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

南方紅豆杉愈傷組織：以南方紅豆杉一年生枝條為外植體誘導(dǎo)獲得，傳至5代以上。

真菌DF：江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室自行分離保存的真菌。

培養(yǎng)基：改良B5液體培養(yǎng)基[8]、PD培養(yǎng)基[9]。

1.2 方法

1）細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)的測(cè)定。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物收獲后，減壓抽濾，獲得鮮細(xì)胞，稱重。

細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)=（收獲量-接種量）/接種量×100%。

2）真菌誘導(dǎo)子的制備。將真菌接種于PD培養(yǎng)基上，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)60 h。4層紗布過(guò)濾，收集菌體，蒸餾水洗滌2次，擰干水分，得濕菌體。真菌誘導(dǎo)子制備方法參照蘭文智等[10]的酸解法制備，冷凍保存。誘導(dǎo)子以總糖含量計(jì)算濃度，總糖含量以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用蒽酮-硫酸比色法[11]測(cè)定。endprint

3）紫杉醇提取與含量的測(cè)定。在228 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定不同濃度紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的吸光光度值，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=20.83 x+1.06，R=0.997。

胞外紫杉醇提取參照李永成等[12]的方法，胞內(nèi)紫杉醇提取參照莊曉蕾等[13]的方法，含量的測(cè)定采用莊曉蕾等[13]的TLC-紫外分光光度法。

總紫杉醇含量=胞內(nèi)紫杉醇含量+胞外紫杉醇含量。

4）不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響。真菌誘導(dǎo)子添加濃度：細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至第8天，分別添加濃度為0、10、100、500、1 000 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子，繼續(xù)培養(yǎng)第16天后收獲，測(cè)定細(xì)胞鮮重和紫杉醇的含量。

5）誘導(dǎo)子添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響。分別在第0、4、8、12、16天加入100 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至第16天時(shí)收獲，測(cè)定細(xì)胞鮮重和紫杉醇的含量。

6）誘導(dǎo)子持續(xù)作用時(shí)間的研究。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至第8天，添加100 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子，空白對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌蒸餾水，分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第8、10、12、14、16天收獲細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞鮮重和紫杉醇的含量。以上培養(yǎng)條件均為細(xì)胞接種量0.08 g/mL，裝液量20 mL/250 mL，（24±1） ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min。

7）PPO和PAL活性的測(cè)定。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至第8天，添加100 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子，空白對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌蒸餾水，分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第8、10、12、14、16天收獲細(xì)胞用于測(cè)定酶活，PPO測(cè)定參照楊文婷等[14]的方法，PAL測(cè)定參照李永成等[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌誘導(dǎo)子對(duì)南方紅豆杉懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響

從圖1可以看出，低濃度誘導(dǎo)子能較好地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著真菌誘導(dǎo)子濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)逐漸增加，當(dāng)誘導(dǎo)子濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)最大，為24.67%；而當(dāng)誘導(dǎo)子濃度較高時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)放緩，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞懸浮體系中誘導(dǎo)子濃度為100 μg/mL時(shí)，總紫杉醇的含量為1.27 mg/L，高于沒(méi)有添加誘導(dǎo)子時(shí)的紫杉醇含量。濃度繼續(xù)增加時(shí)，紫杉醇含量下降。故在培養(yǎng)基中添加100 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和紫杉醇的合成比較有利。

2.2 真菌誘導(dǎo)子添加時(shí)間對(duì)南方紅豆杉懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)的第8天添加誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至第16天收獲，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為25.21%，總紫杉醇含量為1.66 mg/L，二者均高于其他時(shí)期添加誘導(dǎo)子時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)和總紫杉醇含量，說(shuō)明過(guò)早或過(guò)晚添加誘導(dǎo)子都不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和紫杉醇的合成。

2.3 真菌誘導(dǎo)子持續(xù)作用時(shí)間對(duì)南方紅豆杉懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和紫杉醇含量的影響

如表1所示，和對(duì)照組相比，誘導(dǎo)子的作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞的生物量影響不太大，二者的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)均隨著持續(xù)作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，都在處理后第6天（即細(xì)胞培養(yǎng)的第14天）生物量達(dá)到最大，添加誘導(dǎo)子的試驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)達(dá)35.83%，紫杉醇也呈現(xiàn)一個(gè)較高的水平，為1.44 mg/L。

2.4 添加誘導(dǎo)子對(duì)南方紅豆杉細(xì)胞PPO和PAL活性的影響

如圖3A所示，添加誘導(dǎo)子的試驗(yàn)組和空白對(duì)照的PPO活性變化趨勢(shì)一致，都為先逐步下降后上升。添加誘導(dǎo)子后，試驗(yàn)組的PPO活性低于空白對(duì)照，在第12天時(shí)二者差值達(dá)最大，差值為32.08 U/g。培養(yǎng)至第14天時(shí)，二者酶活相近，隨后至第16天時(shí)，試驗(yàn)組的PPO活性低于空白對(duì)照。說(shuō)明添加誘導(dǎo)子的早期可以抑制PPO活性，這將有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。

隨著時(shí)間的變化，PAL活性在逐漸變化，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（圖3B）。添加誘導(dǎo)子后，試驗(yàn)組PAL活性都低于空白對(duì)照，在第10天時(shí)，二者相差最大，差值達(dá)18.44 U/g；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，二者差距越來(lái)越小，在第16天時(shí)，二者趨于相同。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是解決紫杉醇短缺的有效方法[16]。試驗(yàn)研究了南方紅豆杉懸浮培養(yǎng)條件，探究真菌誘導(dǎo)子對(duì)懸浮體系的影響。大量研究表明，添加外源真菌誘導(dǎo)子能促進(jìn)植物細(xì)胞積累次生代謝產(chǎn)物，植物細(xì)胞培養(yǎng)中常用來(lái)提高次生代謝物的產(chǎn)量[17]。真菌誘導(dǎo)子的添加量以多糖含量來(lái)計(jì)，真菌誘導(dǎo)子中對(duì)細(xì)胞具有誘導(dǎo)活性的組分有可能為多糖物質(zhì)[18]。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，在適宜的時(shí)間段加入適宜濃度的真菌誘導(dǎo)子可以明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的積累。李家儒等[19]在細(xì)胞生長(zhǎng)第20天每100 mL培養(yǎng)液加入2 mL桔青霉誘導(dǎo)子，可使胞內(nèi)的紫杉醇含量達(dá)199.1 μg/gDW。本研究表明，在南方紅豆杉懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的第8天加入100 μg/mL真菌誘導(dǎo)子，可以明顯增加懸浮細(xì)胞的生物量，同時(shí)紫杉醇的含量也有提高，過(guò)早或過(guò)晚添加誘導(dǎo)子均不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和紫杉醇的合成。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，代謝產(chǎn)物合成量會(huì)隨著誘導(dǎo)子濃度的增加而上升，不過(guò)誘導(dǎo)子濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的負(fù)面作用。在細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定期的初期添加誘導(dǎo)子，由于此時(shí)細(xì)胞活力較高，外源的誘導(dǎo)子并不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，反而有可能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，也能促進(jìn)其產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物。

PPO參與酚類物質(zhì)的氧化，與褐化有直接關(guān)系，而褐化會(huì)使細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)受到抑制。通過(guò)降低細(xì)胞PPO活性有助于提高紅豆杉愈傷組織的生物量[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加誘導(dǎo)子后，細(xì)胞PPO活性明顯降低，細(xì)胞褐化程度小，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，從而進(jìn)一步提高紫杉醇的產(chǎn)量。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，是催化產(chǎn)生木質(zhì)素的關(guān)鍵酶，木質(zhì)素參與細(xì)胞壁的合成，可以使受侵染部位木質(zhì)化，增強(qiáng)細(xì)胞抗穿透的能力[21]。加入誘導(dǎo)子的前期，PAL酶活升高，隨后逐漸下降，說(shuō)明細(xì)胞受到真菌誘導(dǎo)后發(fā)生了防御反應(yīng)，由此推測(cè)苯丙烷類代謝途徑可能參與了真菌誘導(dǎo)紫杉醇的合成。endprint