厭氧脅迫對發芽糙米中γ-氨基丁酸含量變化的影響

丁俊胄 楊特武 周 強 董夢釔 熊善柏 趙思明

（華中農業大學食品科技學院1，武漢 430070）

（華中農業大學植物科技學院2，武漢 430070）

（黃岡市農業科學院3，黃岡 438000）

厭氧脅迫對發芽糙米中γ-氨基丁酸含量變化的影響

丁俊胄1楊特武2周 強3董夢釔1熊善柏1趙思明1

（華中農業大學食品科技學院1，武漢 430070）

（華中農業大學植物科技學院2，武漢 430070）

（黃岡市農業科學院3，黃岡 438000）

以秈稻“揚兩優6號”為材料，利用CO2和N2在糙米萌發不同階段制造厭氧環境，研究不同氣體種類的厭氧脅迫及處理時間對發芽糙米中GABA積累的影響，探討促進發芽糙米中GABA積累的適宜工藝。結果表明，CO2和N2厭氧處理時段以及持續時間均對發芽糙米中的GABA含量有顯著影響（P＜0.05）。在發芽前期進行厭氧處理一般會抑制GABA的積累，在發芽中后期，尤其是在發芽60～72 h時段則起顯著促進作用（P＜0.05），且CO2的促進效果明顯優于N2（P＜0.05）。發芽0～12 h期間進行厭氧處理會抑制GAD活力（P＜0.05），在發芽24～72 h期間則可以顯著提高GAD活力（P＜0.05）。糙米在發芽66～72 h期間進行CO2厭氧環境處理，在72 h時發芽糙米中GABA含量為（965.44±29.35）mg／100 g（干基），顯著高于其他時段處理后的含量，且比未經過厭氧處理的發芽糙米高出460.13 mg／100 g（干基）。

糙米 發芽 γ-氨基丁酸 厭氧脅迫 CO2N2

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）可顯著改善神經感知功能進而延緩大腦衰老［1-3］，臨床研究證實，GABA有助于治療精神分裂癥［4］，攝入50～100 mg GABA便可以有效舒緩神經緊張，提升精神抗壓能力［5］，還能有效預防和緩解高血壓［6-7］。然而，人體自身積累GABA的能力隨著年齡增長逐漸下降［8］，通過提高谷物類主食中的GABA含量來增加GABA的日常攝入對人們尤其是老年人及高壓人群的健康大有裨益。糙米在適宜條件下發芽后GABA等小分子營養物質含量顯著增加，GABA的開發利用與營養富集技術是近年來研究熱點之一［9-10］，但目前市場上發芽糙米及其制品中GABA的含量尚有待進一步提高。

高等植物在逆境脅迫下，GABA能起到應激信號的作用，其積累可顯著提高植物的抗逆性［11］。Akihiro等［12］和 Allan等［13］學者報道了水稻、番茄、煙草等高等植物中GABA代謝路徑及作用機制，在厭氧脅迫下，GABA含量在一定時間內均會顯著升高［14］，且不同形式和程度的厭氧脅迫引起GABA含量增加的幅度與其達到最高響應值時的時間均不同［15］。Bai等［16］通過浸漬隔氧營造厭氧環境有效提高了粟谷發芽后的GABA含量，然而研究不同氣體在不同發芽時段制造厭氧脅迫對發芽糙米中GABA含量的影響鮮見報道。本研究通過充入CO2和N2對糙米發芽過程（0～72 h）中特定時段進行厭氧脅迫，促進發芽過程中GABA的合成積累，為進一步提高發芽糙米制品中的GABA含量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糙米原料

糙米原料由2012年收獲的雜交秈稻品種“揚兩優6號”經壟谷制備。

1.1.2 試驗試劑

GABA標品：美國 Sigma公司；L-谷氨酸（LGlu）：上海伯奧生物科技有限公司；磷酸吡多醛（PLP）：北京拜爾迪生物公司；其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 試驗設備

FE20型臺式 pH計：美國 Orion Research Inc.；HP250GS型智能人工氣候箱：武漢瑞華儀器設備有限公司；DZ400／ZD型充氣／真空包裝機（排氧量20 m3／h，極限真空度1.333 kPa）：上海余特包裝機械制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發芽糙米制備

使用礱谷機制備糙米并精選，稱取一定質量的糙米于30℃純凈水中浸泡12 h，然后取出置于自行設計改裝的超聲波水霧供濕通氣培養裝置（ZL201010221392.6）中，按照文獻［17］中的方法進行發芽。

1.3.2 氣調厭氧脅迫試驗設計

糙米儲藏包裝材料采用加厚型聚丙烯透明袋。

試驗一：發芽試驗開始后 0、12、24、36、48、60 h取出小型發芽器裝入袋中，分別充入CO2和N2后密封制造持續12 h的厭氧環境，并在各脅迫終點取樣測定GABA含量、GAD活力、浸提液pH值，以未經厭氧處理的發芽糙米（連續發芽時間分別為12、24、36、48、60、72 h）作對照。

試驗二：發芽試驗開始后 0、12、24、36、48、60 h取出樣品，應用CO2、N2處理12 h，結束脅迫后繼續避光、保溫、供濕、通氣培養至72 h，取樣測定糙米芽長和GABA含量，以未進行厭氧處理的發芽糙米為對照。

試驗三：發芽試驗開始后 60、62、64、66、68、70 h再進行厭氧處理，至發芽72 h時解除厭氧脅迫，取樣檢測。

1.3.3 發芽糙米中GABA含量的測定

［17］的方法測定發芽糙米樣品中GABA的含量。

1.3.4 發芽糙米中谷氨酸脫羧酶的提取及活力測定

參考Bartyzel等［18］的方法配制谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）提取液及反應液，按照文獻［17］中使用的方法測定GAD活性。

1.3.5 發芽糙米的組織酸度測定

采用發芽糙米浸提液的pH值表示組織酸度。取2.5 g發芽糙米，用純凈水研磨成漿，定容至50 mL，振蕩浸提2 h后靜置澄清，使用pH計測定浸提上清液pH值。

1.4 數據處理與分析

各組試驗3次重復，各個指標測定3次平行。應用Excel 2007繪圖，使用SAS8.1統計軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同發芽時段厭氧脅迫處理對發芽糙米GABA含量和組織酸化的影響

GAD是GABA的關鍵限速酶，最適pH為5.9。厭氧環境引起植物組織酸化，促進GABA的合成代謝，GABA的合成可在一定程度上緩解過度酸化。本試驗測定了不同時段的厭氧脅迫下發芽糙米中GABA含量、GAD酶活、組織酸度。

2.1.1 GABA含量

隨著發芽時間的延長，糙米中GABA含量整體呈現上升趨勢，36 h后含量增加顯著（P＜0.05）。由圖1可知，氣體脅迫處理對GABA含量均有顯著影響（P＜0.05），CO2與N2的脅迫效果差異明顯（P＜0.05）；0～12 h采用CO2處理會使糙米中GABA含量減少，而在發芽24、36、48、60 h后采用 CO2厭氧處理12 h則使糙米中的GABA含量顯著升高（P＜0.05）；在發芽0～12、12～24、24～36、36～48 h期間采用 N2進行厭氧處理會降低發芽糙米中GABA含量，在發芽48、60 h后進行N2處理12 h則可顯著提高GABA含量（P＜0.05）。總體而言，在發芽各時段中進行CO2處理對GABA積累的促進效果優于N2處理，發芽后期（48～72 h）進行CO2或N2厭氧處理均可顯著提高GABA的積累量。

圖1 不同發芽時段厭氧脅迫12 h的糙米GABA含量

2.1.2 GAD活力

隨著發芽時間的延長，糙米中GAD活力隨之顯著上升（P＜0.05）。由圖2可知，氣體脅迫處理對GAD活力影響明顯，在發芽早期（0～12 h）CO2或N2厭氧處理會導致GAD活力降低，發芽24、36、48、60 h后進行厭氧處理12 h則會使GAD活力明顯高于未處理的對照樣品（P＜0.05），CO2和N2之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 不同發芽時段厭氧脅迫12 h后的GAD活力

2.1.3 組織酸度

隨著發芽時間的延長，發芽糙米組織的浸提液pH值顯著下降（P＜0.05）。由圖3可知，與未厭氧處理的樣品比較，發芽12～24 h間采用CO2進行厭氧脅迫處理會使組織酸化加劇，pH降低約0.3，而在發芽中后期（24～72 h）進行CO2處理，則pH高于對照。在發芽24～36 h以及60～72 h時段進行N2處理，對組織過度酸化有顯著緩解作用（P＜0.05）。

圖3 各發芽時段進行氣體脅迫12 h后的pH值

2.2 不同發芽時段厭氧脅迫處理對糙米出芽生長及GABA含量的影響

如表1所示，在各時段進行N2和CO2處理均會顯著抑制糙米的胚芽生長（P＜0.05），種子萌發初期的厭氧處理可以抑制乙烯合成，谷物種子在低于空氣中O2含量時萌發速率都會延遲，且當萌發過程中O2含量低至0.2%～0.8%時將誘導次生休眠［19］。由表1可知，CO2對糙米胚芽生長的抑制作用強于N2，處理時間越早則芽長抑制效果越明顯。

表1 不同發芽階段厭氧脅迫處理下糙米萌發72 h的芽長

圖4可見，發芽60～72 h時段厭氧脅迫可顯著提高發芽72 h后的GABA含量（P＜0.05），且CO2效果優于N2。發芽60～72 h時段采用CO2和N2處理，終點時發芽糙米中的GABA干基含量分別為（617.97±21.50）mg／100 g和（533.74±27.60）mg／100 g，比未處理分別高出140.04 mg／100 g和55.81 mg／100 g，提高幅度分別為29.30%和11.68%。

圖4 不同厭氧脅迫時段對糙米發芽72 h時GABA含量的影響

2.3 糙米發芽后期厭氧脅迫承受時間的優化

Kinnersley等［15］報道了低氧脅迫引起高等植物中GABA含量的增加通常需要4～24 h。本研究顯示，當脅迫時長為12 h時，在糙米發芽后60～72 h脅迫處理的GABA含量最高。為尋求提高GABA含量更適合的脅迫時段，在發芽60～72 h期間將厭氧脅迫處理時間分別設置為12、10、8、6、4、2 h進行試驗，發芽72 h后糙米GABA含量測定結果見圖5。

圖5 發芽60 h后不同氣體脅迫時長對發芽72 h時GABA含量的影響

由圖5可知，在發芽66 h后厭氧處理6 h，至發芽終點72 h時GABA明顯高于未處理對照及其他處理時段的樣品，且 CO2處理優于 N2處理。在66～72 h時段采用CO2處理的樣品在72 h時的GABA干基含量為（965.44±29.35）mg／100 g，GABA干基含量高出未處理樣品460.13 mg／100 g。

3 討論

3.1 厭氧脅迫對發芽糙米中GAD活力及GABA積累的影響

GAD是一種鈣調素（Calmodulin，CaM）結合蛋白，其表面有Ca2+／CaM結合域，GAD最適pH值為5.9，鈣離子濃度［20-22］、組織細胞 pH［23］、L-Glu濃度［24］均會影響GAD活性。糙米在發芽過程中LGlu被GAD脫去羧基生成GABA，同時，GABA又在γ-氨基丁酸轉氨酶（aminobutyric acid transaminase，GABA-T）的作用下降解為琥珀酸半醛（succinate semialdehyde，SSA）。在本研究中，CO2和N2制造的厭氧環境可顯著促進GABA在發芽糙米中積累，一方面是由于非生物脅迫下植物細胞內［Ca2+］和［H+］濃度增加，激活GAD活性，提高GABA含量，而GABA含量的升高又可緩解細胞過度酸化，抵御逆境脅迫［25-26］；另一方面，厭氧脅迫導致無氧呼吸，引起琥珀酸半醛脫氫酶（succinate semialdehyde dehydrogenase，SSADH）活性的降低，導致琥珀酸半醛積累，反饋抑制 GABA-T活力，從而減慢GABA消耗［12］。進一步深入研究不同脅迫條件對GABA-T、SSADH活性、細胞中Ca2+及鈣調蛋白表達量的影響程度，可以系統闡釋不同脅迫條件對糙米發芽過程GABA積累的影響機制。

3.2 不同氣體種類及厭氧脅迫時段對發芽糙米中GABA積累的影響

文獻［27］報道了糙米在有氧環境下發芽0～72 h過程蛋白酶及GAD活力呈升上趨勢。本研究顯示，在發芽前期（0～24 h）進行厭氧處理不利于GABA積累，可能是因為萌發初期種子內貯藏物質尚未充分動員，GAD活力及蛋白酶分解貯藏蛋白產生的L-Glu濃度含量不足。在有氧環境下隨著發芽時間的延長，糙米組織pH呈下降趨勢，在發芽中后期（36～72 h）進行CO2處理顯著減緩pH的下降，這是因為發芽中后期 GABA積累能力較強，GABA能消耗［H+］，緩解組織酸化。本研究還顯示，CO2厭氧脅迫對于提高發芽糙米GABA含量的效果優于N2。一方面可能是發芽早期（0～24 h）采用CO2處理后由于CO2溶于水導致pH值降低，加劇組織酸化，一定程度上有助于中后期（36～72 h）GAD活力上升和GABA合成；另一方面可能是因為CO2參與發芽過程的碳代謝［11］，促進GABA合成。由此可見，發芽糙米GABA的積累在發芽前期需要氧的參與，在發芽48 h之后才能形成有效的厭氧脅迫應激機制，促進GABA的積累。

4 結論

厭氧脅迫對發芽糙米的胚芽長、GABA含量及GAD活力均存在顯著影響。在發芽后期（48～72 h）更適合進行厭氧脅迫促進GABA積累，CO2和N2處理均可提高GABA含量及GAD活力，且CO2處理效果優于N2。本試驗最佳厭氧處理方式是在糙米發芽66 h后開始進行持續6 h的CO2處理，脅迫終點時發芽糙米中GABA干基含量為（965.44±29.35）mg／100 g，顯著高于其他處理時段，比未處理的樣品高出460.13 mg／100 g。

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γ-Aminobutyric Acid Concent of Brown Rice Induced by Hypoxia Stress During Germination

Ding Junzhou1Yang Tewu2Zhou Qiang3Dong Mengyi1Xiong Shanbai1Zhao Siming1

（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University1，Wuhan 430070）
（College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University2，Wuhan 430070）
（Huang Gang Academy of Agricultural Sciences3，Huanggang 438000）

Yang Liang You No.6，an indica rice cultivar，have been utilized as the material to research the influence of hypoxia stress on GABA accumulation.The hypoxia stresses induced by gas（CO2and N2）at different stages of germinating have been studied.The effects of hypoxia stress on the shoot length，GABA content，GAD activity and acidity（pH）were also determined.The treatment stage，duration and species of hypoxia stress had significantly impact on GABA accumulation（P＜0.05）.Hypoxia stress inhibited GABA accumulation at the early stage，but promoted it at the later stage of germination（P＜0.05）especially within 60～72 h.Further，CO2stress showed a higher promotion effect than N2stress（P＜0.05）.The GAD activity was inhibited under hypoxia stress during the 0～12 h of germination，but it was promoted under hypoxia treatment during the 24～72 h of germination.The brown rice treated with CO2stress during the66～72 h of germination had higher GABA content［（965.44±29.35）mg／100 g］（DW）at 72 h of germination，which was 460.13 mg／100 g more than the control and significantly higher than that of the other treatments.

brown rice，germination，GABA，hypoxia stress，CO2，N2

S337

A

1003-0174（2015）02-0006-06

2013-11-03

丁俊胄，男，1988年出生，博士，食品科學

熊善柏，男，1963年出生，教授，水產品及淀粉質食品加工保鮮理論與技術