蠟樣芽胞桿菌計數及鑒定方法的比較

◎ 陸玉芹，陸 鳴，吳張靜，曾世祥，劉曉玉

(南寧市食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530007)

蠟樣芽胞桿菌是一種能形成芽胞的條件致病菌，誤食后可引起人畜腸道疾病，出現腹瀉型或嘔吐型食物中毒。谷物和豆類食品易被蠟樣芽胞桿菌污染，其次是蔬菜和乳制品[1-2]。2018—2020年寶雞市各類食品樣品中均有蠟樣芽胞桿菌污染的情況，2020年珠海市曾出現一起由蠟樣芽胞桿菌引起的家庭聚集性食物中毒事件[3-4]。因此，蠟樣芽胞桿菌檢測方法的研究與應用對于保障食品安全具有重要意義。

本文參考《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》（GB 4789.14—2014）采取MPY涂布法、MPN計數法、顯色培養基涂布法3種不同方法對樣品中的蠟樣芽胞桿菌進行計數并比較是否存在顯著性差異，同時采用不同方法鑒定蠟樣芽胞桿菌并對比不同方法的優劣。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

凍干粉中蠟樣芽胞桿菌定量分析質控樣品，來源于中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

1.2 標準菌株

蠟樣芽胞桿菌（批號：E0067B，廣東環凱微生物科技有限公司）；蘇云金芽胞桿菌（批號：E0058B，廣東環凱微生物科技有限公司；蕈狀芽胞桿菌（批號：2015.57，中國工業微生物菌種保藏管理中心）。

1.3 儀器與試劑

生物安全柜、振蕩培養箱、顯微鏡、全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（VITER 2）、全自動熒光定量PCR分析儀、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、蠟樣芽胞桿菌顯色培養基、蠟樣芽胞桿菌生化鑒定盒和蠟樣芽胞桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）。

1.4 方法

在生物安全柜中無菌開啟西林瓶，樣品開啟后加入5 mL無菌水進行再水化，溶解后吸出放入無菌瓶中，反復用余下的55 mL無菌水清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入無菌瓶中，即得待測樣品原液。

1.4.1 蠟樣芽胞桿菌計數

①MYP平板計數法。將待測樣品原液依次稀釋至10-4，將每個稀釋度以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別涂布于MYP瓊脂平板和顯色培養基，30 ℃培養48 h后進行計數，重復3次。②MPN計數法。將待測樣品原液依次稀釋至10-4，將每個稀釋級的樣液各吸取1 mL，分別接種于3管胰酪胨大豆多黏菌素肉湯。30 ℃培養48 h后從各管移取1環菌液劃線接種到MYP瓊脂平板上，30 ℃培養24 h后觀察是否有典型菌落。重復3次。

1.4.2 蠟樣芽胞桿菌鑒定

選取MYP及顯色培養基平板上典型可疑菌落，按照以下3種方法進行確定。①按照GB 4789.14—2014進行生化實驗；革蘭氏染色后確定細菌鑒定卡的類型后制備菌懸液。②使用VITEK 2 BCL鑒定卡，通過VITEK2 Compact全自動微生物鑒定系統進行可疑菌的鑒定。③按照《出口食品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法實時熒光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）[5]使用蠟樣芽胞桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）進行鑒定，并使用蠟樣芽胞桿菌標準菌株、蘇云金芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌標準菌株作為對照。

2 結果與分析

2.1 3種計數方法計數結果比較

選擇MYP及顯色培養基10-2稀釋度平板上的典型菌落進行生化鑒定，均為蠟樣芽胞桿菌，蠟樣芽胞桿菌計數結果如表1所示。3種方法的檢測結果的平均值分別為1 433 CFU·mL-1、2 400 MPN·mL-1和1 566 CFU·mL-1，質控樣特性值區間為460～3 100 （CFU·mL-1）/（MPN·mL-1），特征值為1 200 （CFU·mL-1）/（MPN·mL-1），3種方法的計數結果均在特征值區間內。

表1 蠟樣芽胞桿菌計數結果統計表

2.2 不同方法鑒定蠟樣芽胞桿菌的比較

從表2可以看到不同菌株各項生化實驗的結果，蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌在MYP和顯色培養基上的菌落形態十分相似，且生化特征區別不大。

表2 菌株傳統生化實驗結果表

標準菌株及質控樣的VITEK 2和PCR-探針法鑒定結果見表3，VITEK 2 Compact的結果均為好的鑒定，但結果顯示VITEK2無法分辨蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌，需要通過進一步生化鑒定來區分。根據《出口食品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法實時熒光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中3.5結果與報告中的要求，陽性對照Ct值＜30，陰性對照無擴增時，該檢測結果有效。本次實驗試劑盒中的陽性對照Ct值為16.36，陰性對照無擴增，此次檢測結果有效。檢測樣本Ct值≤35時，報告為蠟樣芽胞桿菌陽性，陽性樣本按GB/T 4789.14—2014進行確證。在此實驗中，PCR-探針法仍舊無法直接區別出蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌，需要按照GB/T 4789.14—2014中的根狀生長實驗和蛋白質毒素晶體實驗來區分蠟樣芽胞桿菌和相似菌。

表3 菌株VITEK 2及PCR-探針法結果表

3 結論與討論

MPN法檢測結果精密度及重復性較高，但相比平板計數法，MPN法結果與特征值差距較大，數值較高。有研究表明MPN計數法陽性檢出率要明顯高于平板計數法，因為MPN法實驗的第一步要經過48 h的增菌培養，有利于細菌的修復生長，且MPN法檢測限值更低，靈敏度更高，因此它適用于目標菌含量較低的食品[6]。平板法適用于污染較嚴重，目標菌含量較高的食品中蠟樣芽胞桿菌的計數的食品[7]。

VITEK2 Compact和PCR-探針法用時較短就可以初篩出陽性，從獲得疑似菌落到獲得初篩陽性的結果，VITEK2 Compact大約需要14 h，PCR-探針法用時約3 h，國家標準鑒定法則至少需要48 h。傳統國家標準檢測方法的優點是設備簡單，但實驗操作煩瑣、耗時較長且受到培養時間的影響。PCR和VITEK2 compact鑒定法操作簡便，無需經驗豐富的專業人員操作，但檢測成本較高，實時熒光PCR技術可快速區分出蠟樣芽胞桿菌與其他非芽胞桿菌[8]。但是這3種方法都需要進行根狀生長實驗和蛋白毒素晶體實驗排除蕈狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌。根狀生長實驗是挑取菌落劃平行直線于營養瓊脂平板上，30 ℃培養后觀察結果，在日常檢驗中培養24 h即可觀察到蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征，蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長的特征。蛋白質毒素結晶試驗，GB 4789.14—2014[9]中的實驗是將可疑菌落接種于硫酸錳營養瓊脂平板上培養后染色，《出口食品中蠟樣芽胞桿菌檢測方法》（SN/T 0176—2013）是劃線于營養瓊脂培養后染色[10]。目的都是產生游離芽胞，以上各種計數和鑒定的方法各自有優缺點，在日常的檢驗工作中應根據樣品狀況和檢驗的要求選擇合適的檢測方法，方能更有效、準確地完成蠟樣芽胞桿菌的檢驗。