超高效液相色譜-串聯質譜法對蜂蜜中土霉素殘留的檢測

單乃榮孫 甜羅昭軍陳 幸韋 緯班燕桃吳 濤葉云鋒唐 建李錦泉賀敏華

（1.廣西獸藥監察所，廣西南寧 530001；2.廣西養蜂指導站，廣西南寧 530022）

超高效液相色譜-串聯質譜法對蜂蜜中土霉素殘留的檢測

單乃榮1孫 甜2羅昭軍1陳 幸1韋 緯1班燕桃1吳 濤1葉云鋒1唐 建1李錦泉1賀敏華1

（1.廣西獸藥監察所，廣西南寧 530001；2.廣西養蜂指導站，廣西南寧 530022）

建立了蜂蚩中土霉素藥物殘留檢測的超高效液相色譜_串聯質譜檢測方法。以McIlvajne_Na2EDTA緩沖液為提取液，經HLB固相萃取小柱凈化，脫溶劑后用甲醇水溶解，在超高效液相色譜_串聯質譜上進行檢測。土霉素在0～200ng·ml_1濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數R2＞0.999。添加藥物水平40～200μg·kg_1的回收率在65.1～98.7%。土霉素的檢測限為5μg·kg_1，定量限為10 μg·kg_1。方法快速簡便，準確可靠，重現性好，可用于監測蜂蚩中土霉素的含量。

；蜂蚩；土霉素；超高效液相色譜_串聯質譜法

土霉素是最常用四環素類廣譜抗生素藥物之一，具有防治見效快，價格低廉，容易購買的特點，作為獸藥和飼料添加劑在食品動物中廣泛應用。土霉素被非法用于養殖過程中蜂群病蟲害的治療和預防，劑量過大或療程過長，造成土霉素藥物殘留除了其毒副作用對人直接危害外，更為嚴重的是動物性食品中殘留容易誘導人類致病菌產生耐藥性，從而不利于該類藥物在人類疾病的治療[1～3]，因此必須十分重視土霉素在動物性食品中的殘留問題。在歷年國家蜂產品質量安全通報中均有檢出，使得土霉素在蜂產品中的藥物殘留越來越受到關注。目前已發布的 GB/T18932.23-2003《蜂蜜中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定方法液相色譜－串聯質譜法》[4]中凈化需要兩種小柱，處理過程較多，易造成損失，回收率不理想；農業部1025號-12-2008《雞肉、豬肉中四環素類藥物殘留檢測 液相色譜－串聯質譜法》[5]，由于受蜂蜜樣品基質影響分析結果較大，也不適用。我們通過飼喂試驗，考察土霉素在蜂蜜中的代謝過程，并對樣品前處理和儀器條件進行研究，改進后的方法快速簡便，準確可靠，重現性好，為有效監控蜂蜜樣品中土霉素藥物殘留提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters，TSQ QUANTUMACCESS，配有電噴霧電離源）；N-EVAP 112氮吹儀，美國Organomatian assocaiate公司；3K15高速冷凍離心機，美國Sigma公司；HY-54回旋振蕩器，國華電器有限公司；精密pH計，梅特勒公司；Mettler AE 240分析天平（感量0.0001 g）；Mettler PL602-S電子天平（感量0.01 g）；美國Waters固相萃取裝置。

1.1.2 試劑 土霉素對照品來自中國獸醫藥品監察所，批號為K0031208，含量89.5%；有效期未標示；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、甲酸；水為實驗室一級水；HLB固相萃取柱，60 mg，3cc，美國Waters公司。

1.1.3 制備試劑 氫氧化鈉溶液（1.0 mol·L-1）：稱取氫氧化鈉1 g，加水溶解并稀釋至100 mL；McIlvaine-Na2EDTA緩沖液：分別取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 ml溶解，用1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液調pH至4.0±0.5，加水稀釋至1000 ml；0.1%甲酸水溶液，取1 ml甲酸用水稀釋至1000 ml。

1.2 陽性樣品制備

通過人為在花粉和蜂蜜中添加藥物飼喂至蜂群，選用“藥物+蜂蜜”、“藥物+花粉”兩種方式進行平行試驗；用藥量為常規用量的2倍（參照成人用藥量飼喂10脾蜂為常規用量），喂藥7、21、45日后取蜜檢測。

1.3 對照品溶液制備

土霉素標準儲備液的配制：取土霉素對照品適量，精密稱定，按土霉素計，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1mg·ml-1的溶液，作為標準儲備液。置-20℃冰箱中保存，有效期為1個月。

土霉素標準工作液的配制：準確量取適量標準儲備液，用初始流動相稀釋成適宜濃度的土霉素標準工作液。臨用前配制。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC BEH C18柱 100 mm×2.1 mm，粒度1.7 μm；色譜柱溫30 ℃；流速0.25 ml·min-1；進樣量2μl；流動相為A：0.1%的甲酸水溶液，B：乙腈，采用梯度洗脫：0 min～6 min，90%A線性變化至62%，6～7 min，62%A線性變化至90%A，7 min～9 min，90%A。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子化，正離子檢測，噴霧電壓4000 V，離子傳輸管溫度400 ℃，鞘氣流速15 L·min-1，碰撞氣為氬氣，定性離子對、定量離子對及碰撞能量的參考值見表1。

表1 土霉素的質譜條件

1.4.3 定性與定量 該方法定性滿足四個條件：①試劑空白和樣品空白不能出現與陽性對照相同的離子峰；②特征離子色譜峰的信噪比（S/N）都在3：1以上；③試樣溶液色譜峰保留時間，應與校正溶液的一致，允許偏差為±2.5%；④試樣溶液離子豐度比應與校正溶液一致，定量時以響應強度最強離子作為定量離子對進行計算。

1.4.4 標準曲線的繪制 依次準確移取標準工作液適量，用空白樣品提取液稀釋成濃度為土霉素0、10、20、40、60、100、200 ng·mL-1的系列標準溶液，由低濃度到高濃度進樣，按照液相色譜條件分析，以色譜峰面積為縱坐標，對應標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.5 樣品溶液的前處理 稱取（2±0.05）g樣品，置10 ml容量瓶中，加入McIlvaine-Na2EDTA緩沖液至刻度，充分混勻，振搖30 min，9000 r·min-1離心10min，溫度低于10 ℃，備用。

精密量取備用液5 ml過HLB小柱（用甲醇、水各5 ml預洗活化），用水、5%甲醇水溶液各5 ml淋洗，減壓抽干。用甲醇5 ml洗脫，減壓抽干，收集洗脫液，洗脫液用水浴氮氣吹干（溫度低于40℃），用0.1%甲酸水1 ml充分溶解殘余物，過濾膜后作為試樣溶液，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4.6 靈敏度確定 將適量藥物加入到空白蜂蜜中，制成2、5、10μg·kg-1的三個濃度添加樣品，經上述方法進行處理后，用LC－MS/MS檢測。觀察藥物特征離子質量色譜峰的信噪比（S/N）和對應藥物濃度，（S/N）＞3者定其為方法檢測限；（S/N）＞10者定為其方法定量限。

1.4.7 準確度和精確度的確定

采用標準添加方法，取土霉素標準工作液適量，分別添加到空白蜂蜜中，制得濃度為40、100、200 μg·L-1的系列空白添加試料（低、中、高三個濃度），每個濃度做6個平行試驗，重復3次，求批內批間相對標準偏差。

表2 蜂蜜中添加土霉素的精密度、回收率試驗測定結果

2 結果與分析

2.1 標準曲線

按照上述配制方法，土霉素在0～200 ng·mL-1的濃度范圍內線性關系良好，得回歸方程為y=18341x+10106，相關系數R2＞0.999。

2.2 方法靈敏度

按上述方法進行處理，結果顯示方法檢測限為5μg·kg-1，定量限為10μg·kg-1。空白蜂蜜、空白蜂蜜添加土霉素的總離子流圖（Total Ion Current，TIC）和特征離子質量色譜圖見圖1、2。

2.3 精密度和回收率試驗

按上述1.4.5方法進行處理，分別計算批內和批間精密度和回收率結果見表2。該方法準確度較高，回收率65.0%以上，批內變異系數小于12%，批間變異系數小于3%。

2.4 分組飼喂土霉素實驗的檢測結果

分組飼喂土霉素，不同方式在不同時間點的蜂蜜中土霉素濃度的實驗的檢測結果見表3，從表中可看出蜂蜜在給藥7d后，土霉素+蜂蜜給藥方式土霉素藥物濃度最高為820×10 μg.kg-1，土霉素+花粉方式45d的土霉素藥物濃度最小為2.38 μg.kg-1。蜂蜜中土霉素沒有雜質干擾且峰形良好，具體見圖3。

表3 飼喂土霉素含量測定結果

圖1 空白蜂蜜樣品溶液TIC和特征離子色譜圖

圖2 空白樣品添加土霉素對照品溶液TIC和特征離子色譜圖（10 μg·kg-1）

圖3 飼喂土霉素的蜂蜜樣品溶液TIC和特征離子色譜圖

2.5 色譜條件的優化

本方法比較了甲醇和乙腈、水和0.1%、0.3%甲酸水溶液作為流動相對分離的影響。在C18色譜柱上乙腈的分離度優于甲醇，甲醇水溶液優于水。結果0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脫對樣品進行分析，土霉素色譜峰形對稱性良好。

3 討論

3.1 前處理方法的優化

本方法通過對樣品前處理條件的充分優化改進，建立了適用于蜂蜜中土霉素藥物殘留檢測的UPLC－MS/MS方法。與GB/T 18932.23-2003比較，該檢測方法快速、簡便、結果可靠，靈敏度和精確度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

3.2 安全風險

通過此次試驗，同劑量藥物的兩種喂藥方式在蜂蜜中均檢測出高濃度藥物，蜂蜜中土霉素放置時間的延長，藥物濃度明顯地消減，45天后檢測結果顯示仍然有殘留，說明無論是“花粉+藥物”還是“蜂蜜+藥物”的用藥方式，均會造成產品污染，影響產品安全，并且代謝時間長，養殖過程中應禁止使用。

[1] 許喜蘭，許曉君.蜂產品中藥物殘留的來源及其控制措施[J].養蜂科技，2004，（6）：24.

[2] 閆小峰.四環素類抗生素殘留檢測方法研究進展[J]中國獸藥雜志，2010，44（5）：47-50.

[3] 張鑫，吳劍平，李丹妮，等.UPLC－MS/MS檢測七種動物源食品中四環素類藥物殘留量的研究[J].中國獸藥雜志，2015，49（12）：36-42.

單乃榮（1969—），女，獸醫師，主要從事畜禽產品安全、獸藥殘留檢測與研究。