體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

潘　勇　艾玉峰

作者單位：第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科中心（西安710032）

摘要目的：研究在體外培養(yǎng)條件下兔血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(E CCM)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Endothelial-coverting enzyme inhibit or)Phosphoramidon 對血管平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖的影響，同時研究了血管平滑肌細(xì)胞條件 培養(yǎng)基(SMCCM)對血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖方面的影響。方法：EC和SMC均來源于兔主動脈，在 獲得了EC和SMC的條件培養(yǎng)基(CM)后，分別用兩者以及ET-1進(jìn)行實驗，細(xì)胞的增殖率通過 3H摻入法進(jìn)行測定。結(jié)果：ECCM和ET-1可明顯促進(jìn)SMC的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性。其最大 效應(yīng)分別為190%±11%(100% ECCM)和166%±9%(100pg/ml ET-1)。而Phosphoramidon存在條 件下的ECCM使其分裂作用降低33%±2%。SMCCM抑制EC的增殖，這種抑制作用并非劑量依賴性 ，其最大的抑制效應(yīng)為基本水平的78%±3%。結(jié)論：ECCM和ET-1可促進(jìn)SMC的增殖。Phospho ramidon可明顯地抑制ECCM對SMC的增殖作用。同時SMCCM對EC的增殖起抑制作用。

關(guān)鍵詞血管內(nèi)皮細(xì)胞血管平滑肌細(xì)胞增殖

MODULATIONS OF PROLIFERATION BETWEEN VASCULAR ENDOTHELIAL CELL AND VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELL IN VITRO

Pan YongAi Yufeng

Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital,Fourth Military Medical Uni versity(Xian 710032)

ＡｂｓｔｒａｃｔAim:To study the effects of vascular end othelial cell conditioned medium(ECCM), endothelin-1 (ET-1), Endothelin-conve rting enzyme inhibitor Phosphoramidon on the proliferation of vascular smooth mu scle cell (SMC) and vascular smooth muscle cell conditioned medium(SMCCM) on theproliferation of vascular endothelial cell(EC)in vitro.Methods:EC and SMC wereisolated from rabbit aortas and cultured.The conditioned medium(CM) of EC and SM C were harvested.ECCM,ECCM conditioned in the presence of Phosphoramidon,SMCCM a nd ET-1 were added individually to the cultures.Proliferation rate of the cellswas measured with 3 H-thymidine incorporation on 3 days.Result:ECCM and E T-1 significantly increased the proliferation of SMC in a dose-dependent manne r with a maximal effect of 199%±11%(100% ECCM) and 166%±9%(100pg/ml ET-1)resp ectively.ECCM conditioned in the presence of Phosphoramidon reduced the mitogeni c effect by 33%±2%.SMC conditioned medium elicited a dose dependent decrease ofcultured EC proliferation with a maximal effect of 78%±3% over basal level.C onclusion:ECCM and ET-1 had a mitogenic effect on SMC.Phosphoramidon could sign ificantly reduce the mitogenic effect of ECCM.SMCCM had an effective inhibitionon EC proliferation.

ＫｅｙｗｏｒｄｓVascular endothelial cellVascular smoo th muscle cellProliferation

血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和平滑肌細(xì)胞(SMC)是大血管壁的兩種主要細(xì)胞 類型，在結(jié)構(gòu)及功能上存在密切聯(lián)系，血管內(nèi)皮層的完整對血管的穩(wěn)定性起著很大作用 ^〔1〕，EC通過釋放血管收縮和舒張物質(zhì)，且在二者的相互影響下調(diào)節(jié)著血管的緊張程度 。此外SMC也影響著EC血管活性因子的合成與分泌。本研究是組織工程人工血管實驗研究的 一部分，其目的是為EC和SMC間復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，即有關(guān)細(xì)胞復(fù)制、生長因子活性和增殖方 面提供一定的實驗依據(jù)。本實驗主要研究①血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ECCM)、內(nèi)皮素-1(ET -1)和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Endothelial-coverting enzyme inhibitor)Phosphoramidon存在條件下ECCM對SMC增殖的影響作用；②血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SMCCM)對體外培養(yǎng)的 EC增殖作用的影響。實驗采用細(xì)胞培養(yǎng)方法排除血管壁其它組成部分可能存在的干擾作用。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

EC來源于重2.5kg～3.0kg新西蘭雄性家兔的主動脈。家兔由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提 供。動物經(jīng)戊巴比妥鈉(30mg～40mg/kg，iv)麻醉后，無菌條件下取出主動脈，迅速放入PBS 液中。將血管內(nèi)徑翻轉(zhuǎn)，沖凈內(nèi)壁后，放入含1mg/ml膠原酶(Ⅰ型，Gibco公司)、4mg/ml牛 血清白蛋白的DMEM(Dulbeccos midufued Eagle medium,Gibco公司)培養(yǎng)液中，放于37℃條 件下25分鐘。收集消化液并離心，將離心下的兔主動脈EC吹打均勻，培養(yǎng)在含20%新生牛血 清(Hyclone公司)的DMEM液中。當(dāng)細(xì)胞融合為單層時，用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。實 驗采用的EC為第3～8代細(xì)胞。SMC采用組織塊法進(jìn)行培養(yǎng)，即將血管平滑肌層切割成1.0mm₃2的小塊，然后在10%新生牛血清(Hyclone公司)的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣。每周更換培養(yǎng)液2次。當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到相對融合狀態(tài)時，用 0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。實驗采用的SMC為第2～6代細(xì)胞。

1.2條件培養(yǎng)液(CM)收集

為了獲得CM，將兩種細(xì)胞分別種植于24孔培養(yǎng)板中(EC和SMC分別為10⁵/孔)，加入含10%新 生牛血清的1ml DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后即牢固地貼附在每孔的底部形成單層。第二日 ，用無血清的DMEM培養(yǎng)液清洗孔內(nèi)的EC或SMC各四次。在第3次和第4次沖洗的間隔中，將細(xì) 胞在無血清的DMEM培養(yǎng)液、37℃條件下培養(yǎng)3小時，以便更完全地去除血清蛋白。在4次沖洗 完成后，1ml無血清DMEM培養(yǎng)液加入到EC或SMC培養(yǎng)的孔中。其中部分EC的培養(yǎng)板孔中，加入 含10μ mol/l Phosphoramidon的1ml無血清DMEM培養(yǎng)液。在繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，ECCM或SMCC M加入到培養(yǎng)細(xì)胞中以測定其對細(xì)胞增殖的影響。

1.3ET-1和Phosphoramidon

在體外條件下，測定內(nèi)皮素對SMC增殖的刺激作用時，應(yīng)用的是合成的內(nèi)皮素-1(ET-1，F(xiàn)l uca 公司)。ET-1溶液是將其溶解于無血清的DMEM培養(yǎng)液中配制而成。其用于SMC增殖試驗 濃度介于0.01pg/ml和100pg/ml之間。將含Phosphoramidon(10μ mol/L)的ECCM加入到培養(yǎng) 的SMC中，以估計ECCM中ET-1對SMC生長的作用。

1.4細(xì)胞增殖的測定

細(xì)胞增殖的測定是采用常見的³H摻入法。簡要地說，分別將EC和SMC用胰蛋白酶消化后， 接種在96孔板中(10⁴2/孔)，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(100μl/孔)。細(xì)胞培養(yǎng)過 夜后，類似于收集條件培養(yǎng)基一樣，用無血清DMEM培養(yǎng)液連續(xù)沖洗4次。沖洗完成后，ECCM 加入到SMC培養(yǎng)系統(tǒng)中。同理，SMCCM加入到EC培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞培養(yǎng)于微孔中，37℃條件下 培養(yǎng)3天。所選擇的培養(yǎng)時間是按Leszczynski等報導(dǎo)的^〔2〕。在培養(yǎng)第3天之前的最 后6個小時內(nèi)，將〔³H〕-TdR(3.7kBq/10⁴2個細(xì)胞)分別加入到EC和SMC培養(yǎng)系統(tǒng)中。當(dāng) 培養(yǎng)期終止時，沖洗微孔中的細(xì)胞，在β計數(shù)器中收集并記數(shù)。

1.5記數(shù)與統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3次，其結(jié)果表示為±S，統(tǒng)計分析采用單因素方差 分析，差異性顯著(P＜0.05)。

2結(jié)果

2.1條件培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖的影響

所有實驗均采用無血清培養(yǎng)基避免各種血清源性生長調(diào)節(jié)分子的存在。在相差顯微鏡下觀察 EC或SMC在無血清培養(yǎng)液中的形態(tài)、生長方式呈正常狀態(tài)(圖1、2)。在加入條件培養(yǎng)基后， 于無血清條件下培養(yǎng)72小時，EC或SMC同樣無形態(tài)及外觀的改變。

無血清培養(yǎng)條件下相差顯微鏡觀察融合的單層EC呈典型的" 鵝卵石"樣外觀。×200

在無血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)EC 24小時所獲取ECCM有強(qiáng)烈的促增殖作用。不同 濃度的ECCM(25%、50%、100%)可明顯增加SMC的增殖。在培養(yǎng)3天后，與在無血清DMEM培養(yǎng)液 中培養(yǎng)的SMC相比較，ECCM(100%)可使SMC增殖增加90%(P＜0.05)。(圖3)

圖3不同濃度的ECCM作用SMC 3天對其增殖的影響

當(dāng)采用不同濃度的SMCCM(25%、50%、100%)處理EC，隨著濃度增加，EC的增殖 率降低。SMCCM可降低〔³H〕-TdR摻入量約78%(P＜0.05)。(圖4)

2.2ET-1對SMC生長的影響

將外源性的ET-1(0.01～100pg/ml)加入到SMC培養(yǎng)系統(tǒng)中，它可對SMC產(chǎn)生 濃度依賴性增殖作用。ET-1的終濃度為100pg/ml。其最大效應(yīng)為166%±9%(圖5，P ＜0.05)。為了證實ET-1是ECCM中促進(jìn)SMC增殖的主要動力，故在ECCM中加入Phos phoramidon(10μ mol/L)。在ECCM的濃度為15%時，這一處理可使細(xì)胞增殖率降低33%±2%( P＜0.05)，由于Phosphoramidon對SMC的增殖并無作用，故以上結(jié)論得到 了證實。

圖4不同濃度的SMCCM作用EC 3天對其增殖的影響

圖5不同濃度的ET-1作用SMC 3天的增殖狀況。數(shù)值為以與基數(shù)條 件下(指SMC在含ET-1的無血清條件下的增殖狀況)³H摻入量相比的百分?jǐn)?shù)。以上各結(jié)果采 用±S表示(n=3)

3結(jié)論

許多資料顯示EC或SMC，即大血管壁的兩種主要細(xì)胞類型，顯然有能力產(chǎn)生一些細(xì) 胞因子，通過自分泌或旁分泌的方式，影響到細(xì)胞的遷移與增殖^〔3〕。

EC可以合成大量的物質(zhì)如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1) 、ET-1等，它們都可明顯地促進(jìn)SMC的增殖^〔4〕。本實驗表明將EC培養(yǎng)在無血清條 件下所獲得的ECCM可明顯地促進(jìn)SMC的增殖，這一結(jié)論與其它一些研究者的相類似^〔5〕 。將外源性的ET-1加入到培養(yǎng)的SMC中時，它所起到的是一種增殖因子的作用。而且，在 本實驗中，含有內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶抑制劑Phosphoramidon的ECCM將阻礙體外培養(yǎng)的EC的分泌作用 。這一處理減少了ECCM誘導(dǎo)的SMC的增殖作用，從而闡明ET-1可能參與了EC對SMC增殖方面 的調(diào)節(jié)作用。

為進(jìn)一步研究體外條件下EC和SMC之間的相互影響，我們將SMCCM加入到EC培養(yǎng)系統(tǒng)中，結(jié)果 顯示SMCCM對于體外培養(yǎng)的EC具有明顯的抑制作用。

近來，一些作者報導(dǎo)SMC也可能產(chǎn)生某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)，腫瘤 生長因子-β(TGF-β)^〔6〕等。EC是僅有的一種表達(dá)ECGF受體的細(xì)胞^〔7〕 。而且，一些SMC產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對于血管內(nèi)的各種細(xì)胞類型有著不同的作用^〔8〕 。具有多種功能的TGF-β，可促進(jìn)SMC的遷移但同時抑制EC的遷移。也有報導(dǎo)稱SMCCM能 夠明顯地減少EC產(chǎn)生的ET-1，這可能是由于SMC自身產(chǎn)生了一種抗增殖作用，因此細(xì)胞壁的 細(xì)胞與細(xì)胞間必然存在著一定的平衡。我們的結(jié)果與認(rèn)為一個被觀察到的血管反應(yīng)是幾類細(xì) 胞和多種生長調(diào)節(jié)成份相互作用結(jié)果的觀點相一致。為了使組織工程人工血管的研究進(jìn)一步 深化，研究不同條件下血管壁細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子是未來的主要任務(wù)之一。

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收稿日期2000-03-05

編輯/姜如蓉