Wnt/β-catenin信號通路探討重骨顆粒治療肝腎虧虛型膝骨關節(jié)炎的作用機制

程麗麗 尚雙雙 戈揚 湯忠富 徐昌萍 李明 黃傳兵*

1.安徽中醫(yī)藥大學,安徽 合肥 230012

2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科,安徽 合肥 230031

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是易發(fā)生在中老年人群體中的常見關節(jié)疾病,主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨進行性退行性改變,繼發(fā)關節(jié)邊緣骨贅及滑膜慢性炎癥[1]。臨床上以關節(jié)腫脹、疼痛、畸形和活動受限為主癥,極大地影響了患者生活質(zhì)量。目前臨床上KOA治療多使用非甾體類抗炎藥,糖皮質(zhì)激素和軟骨保護劑,嚴重時采用手術方法,臨床療效并不持久,此外因無法根本解決這一問題,病情發(fā)展也不易控制。研究表明,Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號傳導通過直接作用于軟骨和滑膜組織而在骨與關節(jié)病理中發(fā)揮調(diào)控KOA的作用,因此可作為骨關節(jié)炎治療干預的靶標[2]。謝晚晴等[3]曾對基于 Wnt/β-catenin 信號通路的中醫(yī)藥干預骨關節(jié)炎的研究進行綜述,眾多臨床研究表明,中藥包括單味中藥提取物、經(jīng)典成方、臨床效方等基于調(diào)節(jié) Wnt經(jīng)典信號通路改善了OA預后,并發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 通路的途徑包括上調(diào) Wnt 蛋白促進軟骨細胞增殖;下調(diào) Wnt 蛋白抑制Wnt/β-catenin 通路,下調(diào)其下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶( MMPs) 和聚蛋白多糖酶( aggrecanases) ,抑制Ⅱ型膠原、蛋白多糖的降解,起到治療 OA 的作用。

KOA屬中醫(yī)“骨痹”范疇,以肝腎虧虛型居多,臨床治療主要以補益肝腎為主[4]。既往研究表明,補益肝腎類中藥復方(如獨活寄生湯、少陽膝痹方等)可以多成分、多途徑、多靶點的對KOA發(fā)揮明顯的療效[5-6]。本研究主要基于Wnt/β-catenin信號通路探討重骨顆粒治療肝腎虧虛型KOA患者的臨床療效及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1診斷標準:西醫(yī)診斷標準參照1995年ACR制定的KOA標準[7];中醫(yī)診斷標準參考《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(2015年版)》中醫(yī)辨證肝腎虧虛證[8]。

1.1.2納入標準:①符合中、西醫(yī)診斷標準;②近1個月內(nèi)未口服非甾體抗炎藥或其他改善病情藥物,未接受物理療法等治療;③簽署知情同意書者。

1.1.3排除標準:①心腦血管疾病或消化系疾病等;②其他原因的骨關節(jié)炎或者繼發(fā)性骨關節(jié)炎;③對鹽酸氨基葡萄糖膠囊及重骨顆粒過敏者;④哺乳期或者育齡期女性;⑤依從性差,不能堅持治療者。

1.1.4一般資料:選擇60例于2021年12月至2022年12月期間在安徽省中醫(yī)院風濕免疫科住院治療或者門診就診的KOA患者,隨機分為氨基葡萄糖組與重骨顆粒組各30例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核(倫理號:2021AH-76)通過。

1.2 方法

1.2.1基礎治療:參照中華醫(yī)學會《骨關節(jié)炎診療指南(2018版)》[9]中的基礎治療方案對兩組患者進行健康宣教,注意心情的調(diào)攝,飲食起居有節(jié)、避免關節(jié)負重;建議運動治療,適當?shù)墓δ苠憻?例如八段錦、五禽戲等;建議行動輔助等。

1.2.2藥物治療:氨基葡萄糖組(GLU組)給予鹽酸氨基葡萄糖片(江蘇正大清江制藥有限公司生產(chǎn),國藥準字號H20060647,規(guī)格0.75 g)口服,每次1片,每日2次。重骨顆粒組(CGG組)予以口服重骨顆粒方(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供,由杜仲10 g、骨碎補9 g、桑寄生10 g、牛膝10 g、海螵蛸10 g、千年健10 g、鹿銜草10 g組成),每日1付,兩次分服,溫開水送服,飯后服用。治療8周。

1.2.3臨床療效評價標準:參考《中藥新藥臨床研究指導原則》[10]制定療效評價標準。顯效:膝關節(jié)基本處于活動狀態(tài),無疼痛感及僵硬感;有效:膝關節(jié)活動度顯著改善,輕度疼痛感及僵硬感;無效:膝關節(jié)活動度限制,疼痛明顯,嚴重影響生活。

1.2.4中醫(yī)癥狀積分標準:治療前后參照《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(2015年版)》制定的中醫(yī)癥候評分細則對患者的中醫(yī)證候進行評分,中醫(yī)證候評分:主癥:膝關節(jié)疼痛、腫脹、僵硬;次癥:腰膝酸軟、行動不利、全身無力、頭暈耳鳴、失眠多夢;舌脈:舌淡紅或黯、苔薄白或少苔、脈細無力。依據(jù)患者各癥狀表現(xiàn)評級為無、輕、中、重各等級,并記錄為 0、1、2、3 分,舌苔脈象不予以評分。統(tǒng)計各項得分之和。

1.2.5視覺模擬量表(visualanalogue scale,VAS)評分:患者將自己自身感受到的疼痛強度在10 cm長的標尺上相適宜的點標明,分值大小與疼痛程度呈正相關。

1.2.6西安大略和麥克馬斯特大學骨關節(jié)炎指數(shù)(Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index,WOMAC)量表評分[11]:WOMAC 量表分為3個部分,分別為疼痛、僵直、關節(jié)功能,共計24個條目,每個條目最高分為10分,0分至10分指標評分與嚴重程度呈正相關。治療前后記錄患者的WOMAC評分總和。

1.2.7Lysholm評分:用Lysholm量表來評價膝關節(jié)的功能[12]。這個量表包括8個部分,其中痛苦、不安定度部分最高均為25;閉鎖感最高分15分;腫脹度最高10分;跛行最多5分;樓梯攀爬最高10分,蹲姿最高5分;采用支撐物的分值上限為5分,總計100,得分越高表示膝關節(jié)功能就越好。

1.2.8檢測指標:治療前和治療后收集兩組空腹靜脈血,采用魏氏法測定ESR、全自動生化分析儀測定hs-CRP,ELISA法測定IL-6和IL-1β的水平,RT-PCR法測定Wnt1、β-catenin和GSK3β mRNA的表達量。

1.2.9安全性觀察:分別于第1周、第2周、第4周、第8周對患者進行電話通知、門診隨訪觀察,監(jiān)測血常規(guī),尿常規(guī)以及肝腎功能,同時密切注意治療期間患者可能發(fā)生的各種不良反應,若有異常情況發(fā)生,則及時進行記錄和對癥治療。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 兩組受試患者基線結(jié)果

本研究共納入男 21例,女 39例,60名受試者均完成試驗,兩組患者的性別、年齡等基本信息差異無統(tǒng)計學意義,組間具有可比性(P>0.05)。

表1 兩組受試者的基線比較

2.2 臨床療效評價比較

兩組患者臨床療效分布比較,CGG組有效率(86.7 %)優(yōu)于GLU組(56.7 %)(P<0.05)。

表2 兩組受試者的臨床療效評價比較[n(%)]

2.3 中醫(yī)癥狀積分比較

重骨顆粒組和氨基葡萄糖組在治療前中醫(yī)癥狀積分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),2組治療后中醫(yī)癥狀積分均比治療前明顯降低,重骨顆粒組中醫(yī)證候積分(09.90±2.72)明顯低于氨基葡萄糖組(20.06±2.98)(P<0.05)。

表3 兩組患者的中醫(yī)癥狀積分比較

2.4 VAS評分比較

兩組患者治療前的VAS評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),經(jīng)過8周治療后兩組VAS評分均低于治療前(P<0.05)。重骨顆粒組治療后VAS評分表改善較氨基葡萄糖組稍明顯(P<0.05)。

2.5 WOMAC評分比較

兩組患者治療前的WOMAC指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),經(jīng)過8周治療后兩組WOMAC疼痛、僵硬、關節(jié)功能積分均降低(P<0.05)。重骨顆粒組治療后WOMAC評分均低于氨基葡萄糖組(P<0.01)。

表4 兩組受試者的VAS指數(shù)評分比較

2.6 Lysholm評分比較

兩組患者治療前的Lysholm各項評分差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),經(jīng)過8周治療后,除了氨基葡萄糖組在改善腫脹度方面差異不明顯外,其余兩組在疼痛、不安定度、閉鎖感、跛行、樓梯攀爬、蹲姿、使用支撐物方面均較治療前有所改善(P<0.05),而重骨顆粒組較氨基葡萄糖組而言,在除使用支撐物方面無明顯差異外,其余均較氨基葡萄糖組改善明顯(P<0.05或P<0.01)。

表5 兩組患者的WOMAC指數(shù)評分比較Table 5 Comparison of WOMAC index scores between the two

表6 兩組患者的Lysholm評分比較Table 6 Comparison of Lysholm scores between the two

2.7 兩組患者治療前后ESR、hs-CRP、IL-6、IL-1β水平比較

治療前兩組ESR、hs-CRP、 IL-1β、IL-6指標對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),治療后兩組指標均較治療前下降(P<0.01),相較于對照組,重骨顆粒組降低ESR、 hs-CRP、IL-1β、IL-6更為顯著(P<0.05)。

表7 兩組患者ESR、hs-CRP、IL-6、IL-1β比較Table 7 Comparison of ESR, hs-CRP, IL-6 and IL-1β between the two

2.8 兩組患者治療前后Wnt1 、β-catenin、GSK3β mRNA相對表達量比較

如下表所示,治療前兩組患者血清中Wnt1、GSK3β、β-catenin mRNA水平相比較具有可比性(P>0.05),治療后兩組患者GSK3β的水平均明顯上升(P<0.01),Wnt1、β-catenin的水平明顯下降(P<0.01);組間對比后,重骨顆粒組GSK3β的水平上升更顯著(P<0.05),Wnt1、β-catenin水平的下降也更為明顯(P<0.05)。

表8 兩組患者wnt1、GSK3β、β-catenin mRNA相對表達量結(jié)果Table 8 Relative expression levels of wnt1, GSK3β and β-catenin mRNA in two

2.9 安全性比較

在治療期間,兩組患者均未出現(xiàn)肝腎功能異常及其他不良反應。

3 討論

KOA是最常見的關節(jié)炎形式,60歲以上的人中有三分之一受到影響,女性比男性更嚴重。KOA的患病率正在上升,部分原因是OA危險因素的患病率增加,包括肥胖、缺乏身體活動和關節(jié)損傷。OA相關的關節(jié)疼痛會導致功能限制、睡眠不佳、疲勞、情緒低落和失去獨立性[13]。Wnt/β-catenin是Wnt信號通路中經(jīng)典的一條,可以調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和疾病發(fā)病過程中的增殖、分化、再生、衰老和凋亡等。研究表明規(guī)范的Wnt/β-catenin在KOA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。典型的Wnt通路通過調(diào)節(jié)β-catenin水平和β-catenin亞細胞定位觸發(fā)其信號向細胞內(nèi)傳遞。β-catenin的水平在Wnt-off條件下幾乎保持平緩。β-catenin通過β-轉(zhuǎn)導蛋白重復蛋白(β-TrCP)介導的細胞質(zhì)中泛素化降解。這一過程糖原合酶激酶3β(GSK3β)、支架蛋白Axin、大腸腺瘤病息肉病(APC)和酪蛋白激酶1α組成的“破壞復合物”被激活,共同以磷酸化依賴方式降解。在Wnt-on的情況下,Wnt配體與卷曲(FZD)蛋白和低密度脂蛋白受體(LRP)相關蛋白5或6相結(jié)合時會與上述“破壞復合物”相互作用,使β-catenin釋放易位至細胞核。細胞核內(nèi)β-catenin和TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合啟動信號通路[2]。Wnt/β-catenin通路激活后,下游靶基因表達會受到影響,例如 MMP-13、IL-1β等,從而誘發(fā)關節(jié)軟骨炎癥,軟骨基質(zhì)退變,最終形成骨關節(jié)炎[15]。Wnt1作為Wnt通路相關的基因被證實是在OA中表達上調(diào)[16],Wnt1則會激活Wnt/β-catenin通路,使得GSK-3β表達下降,β-catenin的表達增加,進而誘導KOA的發(fā)生發(fā)展。

重骨顆粒是導師黃傳兵主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗,以培補肝腎為基本治則,針對肝腎虧虛型KOA患者創(chuàng)立的基本方,以杜仲、骨碎補為君藥,主補肝腎、強筋骨之功效,臣藥輔以牛膝、桑寄生合用既可補充補肝腎強筋骨之功,牛膝又能引藥下行,疏導藥性直達病所,佐以千年健、鹿銜草祛風濕、止痹痛。補益肝腎則肝氣條達,濡養(yǎng)氣血則氣血通暢,強筋健骨則筋骨疏利。研究發(fā)現(xiàn)該方藥中杜仲、骨碎補、牛膝等均具有改善骨代謝的作用,且機制均與Wnt /β-catenin通路有關。例如張玉苗等[17]網(wǎng)絡藥理學研究結(jié)果顯示杜仲主要調(diào)節(jié) Wnt 信號通路促進成骨細胞增殖。李琰等[18]發(fā)現(xiàn)骨碎補水煎液可以提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度,起到抗骨質(zhì)疏松的作用,其機制與激活 Wnt/β-catenin 經(jīng)典信號通路有關。楊豪等[19]發(fā)現(xiàn)牛膝多糖改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨代謝,其機制也與激活Wnt /β-catenin通路有關。

為了進一步觀察重骨顆粒的臨床療效,評估方案選取了WOMAC評分、VAS評分、Lysholm評分等評價指標。這些量表是目前臨床認可度比較高的膝關節(jié)功能評價量表,雖然各種評分方法側(cè)重點不同,但均能客觀全面地反映患者的主觀狀態(tài),可靠性和靈敏度較高[20]。中醫(yī)評分系統(tǒng)選用了《骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(2015年版)》制定的中醫(yī)癥狀評分,該評分系統(tǒng)較新,能夠全面客觀地反映膝關節(jié)診治的中醫(yī)療效。另外為了初步探索重骨顆粒的療效及基于Wnt/β-catenin信號通路的作用機制,測量了兩組患者治療前后人體外周血中的Wnt1、GSK3β、β-catenin的mRNA表達量、炎癥細胞因子IL-1β、IL-6表達量以及炎癥指標ESR、hs-CRP的水平。RNA在不同組織中是有差異的,不同組織具有不同的功能,自然會表達不同的mRNA。所以血液中RNA和組織中的RNA表達是有區(qū)別的。但考慮到倫理道德層面,患者軟骨組織較難獲取,因此選擇檢測患者血液中的基因相對表達量。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過8周治療后,與氨基葡糖組對比,重骨顆粒組中醫(yī)證候積分明顯降低、臨床有效率明顯提高,提示重骨顆粒能改善如腰膝酸軟,耳鳴等肝腎虧虛。此外,兩組對比,重骨顆粒組在WOMAC疼痛,僵硬,關節(jié)功能積分等比較病情一般活動狀態(tài)指標優(yōu)于氨基葡萄糖組,VAS指標改善程度也高于氨基葡萄糖組(P<0.05),Lysholm評分組間對比還發(fā)現(xiàn)除了支撐物的使用方面以外,重骨顆粒組評分的改善程度均好于氨基葡萄糖組(P<0.05或P<0.01),并且在降低ESR、hs-CRP水平較為顯著(P<0.05),可證明重骨顆粒能夠更加有效地降低疾病活動度和改善臨床癥狀。除此之外,重骨顆粒組GSK3β的水平上升,Wnt1、β-catenin水平的下降也更為明顯(P<0.05或P<0.01),IL-1β、IL-6的表達下降程度顯著,說明重骨顆粒可能抑制了Wnt/β-catenin信號通路,降低了炎癥因子的表達,因此可以認為重骨顆粒可有效抑制炎癥因子的釋放,從而減輕KOA的癥狀,抑制KOA的進展。因此我們認為基于培補肝腎法治療原則創(chuàng)立的重骨顆粒臨床治療肝腎虧虛型KOA療效確切,其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關,值得深入探討。