羥基磷灰石／β－磷酸三鈣／海藻酸鈉復合多孔支架的制備與研究

摘 要 本文討論了羥基磷灰石/β-磷酸三鈣/海藻酸鈉（HAP/β-TCP/AG）多孔支架的制備，并通過電子顯微鏡觀察了其微觀結構、研究其干細胞親和性和生物相容性。研究表明：該多孔支架具有三維連通網(wǎng)狀結構，干細胞在支架上黏附、生長良好，具有良好的干細胞親和性和生物相容性。

關鍵詞 羥基磷灰石，β-磷酸三鈣，海藻酸鈉，多孔支架

1引言

組織工程學是應用細胞生物學和工程學的原理，研究開發(fā)修復、改善損傷組織和功能的生物替代物的一門科學^[1]。組織工程的核心是建立由細胞和載體構成的三維空間復合體。這種三維空間結構，為細胞提供獲取營養(yǎng)、氣體交換、排泄廢物和生長代謝的場所，也是形成新的具有形態(tài)和功能的組織、器官的物質(zhì)基礎。因此，多孔支架材料的研究就成為組織工程研究的重要內(nèi)容之一。

多孔羥基磷灰石（hydroxy-apatite 簡稱HAP）具有與骨組織相似的化學成分和理化性質(zhì)、良好的生物相容性和骨傳導性，作骨置換和修復材料具有很好的應用前景。但其用于骨組織置換還存在很多不足，例如在體內(nèi)的降解速率較慢、骨誘導作用弱、脆性大等，從而使其應用受到一定的限制；β-磷酸三鈣（β-TCP）具有優(yōu)異的生物降解性，植入體內(nèi)能逐漸降解，并被新生骨取代；海藻酸鈉（AG）作為組織工程的載體，有很好的生物醫(yī)學性質(zhì)，承載細胞量大、細胞的生存狀態(tài)接近于體內(nèi)狀態(tài)，有利于細胞基質(zhì)分泌和濃度保持^[2]。因此，本實驗采用有機泡沫浸漬-發(fā)泡法復合^[3～5]成形工藝制備出羥基磷灰石/β-磷酸三鈣多孔支架，再將該多孔支架與海藻酸鈉復合，既可使多孔支架具有可控的生物降解性，同時又可提高材料的生物活性、提高細胞培養(yǎng)密度和代謝活性，為細胞提供更好的粘附生長環(huán)境。

2實驗

2.1 材料

HAP采用實驗室自制的高純HAP粉體，粒度分布在1～10μm^[6]；海藻酸鈉購自昆明市醫(yī)藥公司化玻站；聚氨酯泡沫選用Φ25×5mm 的圓片；發(fā)泡劑用卵磷脂；硝酸鈣、磷酸氫二銨、氨水均為分析純。

2.2 HAP粉體的制備

采用濕法合成羥基磷灰石粉體。首先，配制1.2mol/L Ca(NO₃)₂和0.7mol/L(NH₄)2HPO₄水溶液，然后將(NH₄)2HPO₄溶液緩慢加到Ca(NO₃)₂溶液中，用氨水調(diào)整pH值為10～11，充分攪拌，在45℃左右反應8h后；經(jīng)陳化、清洗、過濾、干燥、熱處理、研磨、過篩后得到粒度為1～10μm的高純羥基磷灰石粉體。

2.3 HAP/β-TCP/AG復合多孔支架的制備

采用有機泡沫浸漬-發(fā)泡法復合造孔成形工藝制備多孔支架：將羥基磷灰石粉體與發(fā)泡劑混合均勻，然后將處理好的有機泡沫載體置于陶瓷漿料中充分浸漬后，在微波爐中進行加熱發(fā)泡，并干燥至陶瓷坯體定型，再在電爐中按圖1所示的燒成制度燒成，得到多孔HAP/β-TCP支架。將海藻酸鈉的蒸餾水溶液緩慢滴加在多孔支架上，甩干、烘干得到復合支架。

圖1 陶瓷樣品的燒成曲線

2.4生物相容性實驗

將上述制得的HAP/β-TCP/AG多孔支架經(jīng)高溫消毒后，放入粘連蛋白溶液中浸泡數(shù)小時，然后放入含有一定數(shù)量人體骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的培養(yǎng)液中，進行體外細胞培養(yǎng)實驗，觀察干細胞在材料上的生長情況。

2.5 性能測試

用飛利浦FEI公司制造的Quanta 200型掃描電鏡（SEM）觀察多孔支架的顯微形貌與結構；用日本理學D/max2200型全自動X-射線衍射儀分析試樣的物相；用傳統(tǒng)方法測定樣品的抗壓強度和孔隙率。

3實驗結果與討論

3.1 HAP/β-TCP支架的煅燒溫度

羥基磷灰石是一種生物性能良好的生物活性材料，但它在高溫下物相容易發(fā)生變化。為了得到最佳燒結溫度和適當?shù)腍AP與β-TCP比例，我們對多孔支架在不同燒結溫度下的物相成分進行了測定，結果如圖2所示。

圖2 不同燒結溫度保溫4h熱處理樣品的X-ray衍射圖樣

從圖2可知：多孔體在1125℃熱處理時物相成分就已經(jīng)發(fā)生了變化:部分羥基磷灰石轉變?yōu)棣?磷酸三鈣。一般認為在1050℃時，HAP就開始向β-磷酸三鈣轉變，其反應方程式為：

Ca10(PO₄)6(OH)2→2β-Ca3(PO₄)2+Ca4P2O9+Ca2P2O7

由圖2可以看出：在保溫時間相同的條件下，隨著燒結溫度的升高，羥基磷灰石向β-磷酸三鈣轉變的量也隨之增加。可見，控制燒結溫度可以控制羥基磷灰石與β-磷酸三鈣的比例。經(jīng)研究，當燒結溫度為1275℃時，所制備的多孔支架具有較高的孔隙率（75%～85%）。所以，實驗采用1275℃作為多孔體的燒結溫度，經(jīng)XRD圖譜分析儀分析計算，所制得的多孔支架中HAP與β-TCP的質(zhì)量比約為3:2。

3.2 HAP/β-TCP/AG復合多孔支架的孔隙分析

3.2.1 支架的孔徑分布

為了分析HAP/β-TCP/AG多孔支架的孔徑分布，我們根據(jù)多孔支架的SEM照片，對其孔徑尺寸進行測定計算，并采用定量金相的方法對孔徑分布進行統(tǒng)計分析，其分析結果如圖3所示。

（a） 宏觀

（b） 微觀孔徑分布

圖3 HAP/β-TCP/AG多孔支架材料的孔徑分布

圖3是多孔HAP/β-TCP/AG支架材料的宏觀和微觀孔徑分布圖，從圖中可以看到：支架的宏觀孔徑分布在100～700μm，其中400～500μm之間的孔所占比例最大；微觀孔徑主要分布在3～10μm。可見，該支架滿足骨組織工程支架的孔徑要求^[9]。支架中宏觀孔的存在有利于材料植入體內(nèi)后細胞的生長及引導新骨長入；微孔的存在有利于組織液滲入，使材料的晶粒發(fā)生溶解，材料與組織和生理環(huán)境的接觸面積也大大增加，從而進一步提高了所制材料的生物相容性和生物降解性。

3.2.2 支架的顯微結構

(a)HAP/β-TCP/AG多孔支架宏觀孔分布 (b)AG形成的網(wǎng)狀微孔結構

(c) AG在支架孔內(nèi)形成的網(wǎng)狀結構 (d) AG網(wǎng)的精細梳妝結構

圖4 HAP/β-TCP/AG多孔支架的SEM照片

圖4是HAP/β-TCP/AG復合多孔支架的微觀形貌。由圖4（a）可看到：該復合多孔支架中含有大量的宏觀孔洞，孔徑和孔形態(tài)不一，并且孔與孔之間成三維連通結構，孔隙率高達75%～85%。這是有機泡沫載體和發(fā)泡劑在熱處理過程中分解后所形成的孔洞。在多孔支架材料的宏觀孔壁上還可觀察到大量微觀孔洞。這些微觀孔洞的形成是由于羥基磷灰石顆粒在燒結過程中，燒結不完全致密，由粉體顆粒堆垛而成。這些微觀孔的存在使相鄰的宏觀孔之間相互連通，并與宏觀孔洞一道，使支架材料形成多孔結構，從而滿足組織工程的需求。

在支架內(nèi)部，海藻酸鈉呈網(wǎng)狀微孔結構附著于基體支架的孔內(nèi)和孔壁上，其精細結構呈梳狀。如圖4b、4c與4d所示。這種結構接近于人體骨組織的結構，可承載大量的細胞，為細胞的黏附和生長提供更好的環(huán)境。

3.3 HAP/β-TCP/AG復合多孔支架的生物相容性

我們對HAP/β-TCP多孔支架和HAP/β-TCP/AG復合多孔支架的生物相容性進行了對比研究。在掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大部分MSCs在接種到HAP/β-TCP／AG復合多孔支架后，很快隨培養(yǎng)基一起進入孔中并在支架上附著了大量干細胞，但在HAP/β-TCP支架上的MSCs量較少。圖5是MSCs在HAP/-TCP/AG復合多孔支架上的生長情況。

(a)圓形MSCs的貼壁生長情況 (b)梭狀MSCs在孔壁的生長情況

(c)梭狀MSCs跨孔生長情況 (d）MSCs長入材料內(nèi)部

圖5 MSCs附著在HAP/β-TCP/AG支架上的微觀形貌

由圖5可觀察到MSCs呈長梭形或圓形，在支架材料表面黏附、伸展、生長良好，并繁殖連接成片覆蓋在材料表面；分泌的細胞外基質(zhì)包圍細胞四周，與細胞相互連接，形成網(wǎng)狀結構；細胞密度明顯高于HAP/β-TCP多孔支架，并且有些細胞還伸入到支架的孔內(nèi)部生長。這說明HAP/β-TCP/AG復合多孔支架具有較好的干細胞親和性和生物相容性，更能有效地提高細胞密度并維持其良好的生長狀態(tài)；它所提供的三維空間有利于細胞的黏附、生長與增殖。這可能是因為海藻酸鈉具有蛋白多糖相似的結構，其凝膠網(wǎng)狀結構可為細胞提供充分的附著面，使細胞生長在一種更類似于生理狀態(tài)的環(huán)境中，有利于細胞保持活性和分泌大量的基質(zhì)。

4結 論

（1） 采用有機泡沫浸漬-發(fā)泡復合成形工藝制備多孔HAP支架，當燒結溫度高于1050℃時，部分HAP會轉變?yōu)棣?TCP，并隨著溫度升高，轉變的量也隨之增加；實驗表明，最適宜的燒結溫度為1275℃。

（2） HAP/β-TCP/AG復合多孔支架中含有大量的宏觀孔和一些微觀孔。宏觀孔洞的孔徑分布在100～700um，其中400～500um之間的孔所占比例最大；微觀孔孔徑主要分布在3～10um。海藻酸鈉的網(wǎng)狀微孔結構可為細胞提供充分的附著面，有利于細胞的黏附生長。

（3） 由體外培養(yǎng)實驗可知，HAP/β-TCP/AG復合多孔支架材料無細胞毒性、具有良好的干細胞親和性和生物相容性。

參考文獻

1 Langer R，Vacanti J P.Tissue Engineering[J].Science， 1993，260(5110):920

2 鄭岳華，侯小妹，楊兆雄.多孔羥基磷灰石生物陶瓷的進展[J]. 硅酸鹽通報，1995，3:2O～28

3 呂 迎，李慕勤.多孔羥基磷灰石生物陶瓷的研究現(xiàn)狀與進展[J].佳木斯大學學報(自然科學版)，2003，21(4):439～444

4 孫 磊，孟國林，竇榆生等.不同濃度的海藻酸鹽與異種骨構建組織工程載體研究[J].中國修復重建外科雜志2003，

2(17):140～142

5 Schwarlder，A.V.Somers.United States Patent[S].US3090， 094，1963

6 M.E.Gome，R.L.Reis.Biodegradable polymers and composites in biomedical applications：from catgut totissue engineering[J].Internationgnal Materials Reviews，2004，49(5):251～273

7 朱新文，江東亮.有機泡沫浸漬工藝——一種經(jīng)濟實用的多孔陶瓷制備工藝[J].硅酸鹽通報，2000，3:45～60

8 丑修建，黃明華，資文華等.濕法合成羥基磷灰石生物陶瓷材料的研究[J].中國陶瓷，2004，40(1)：20～23

9 Liu Dean-Mo.Influence of Solid Loading and ParticleSize Distribution on the Porosity Development of Green Al umina Ceramic Mouldings[J].Ceramics International，1997，23:135～139

Preparation of Porous Hydroxyapatite /β-tricalcium Phosphate / Alginate Scaffold Material

Wang Hongmei1 Chen Qinghua1 Pan Xinghua2 Pang Rongqing2 Chou Xiujian1

(1 Faculty of Materials and Metallurgical EngineeringKunming University of Science and TechnologyKunming 650093

2 Kunming Military Hospital，Kunming 650031)

Abstract: The preparation and biocompatibility of porous HAP/β-TCP/AG scaffold were discussed，and its micro-structure was researched by SEM.The results showed that the scaffold had three-dimensional and connective network configuration.The human mesenchymal stem cells grew and adhered well to the scaffold which indicated that the scaffold had good stem cells biocompatibility.

Keywords: hydroxyapatite，β-tricalcium phosphate，alginate，porous scaffold