番茄葉霉病高抗基因Ｃｆ－９的ＣＡＰＳ標記創建

陳麗靜　李天來　李君明　宋　燕　王玉昆　王孝宣　徐合金

摘要根據番茄葉霉病高抗基因Cf-9的基因序列設計3對特異擴增引物，以近等基因系和本組的多重PCR檢測材料為試材，擴增cf-9基因1～2867bp之間的單拷貝片段，3對引物分別擴增出560bp，1 000bp，1 080bp的特異片段。分別用限制性內切酶TaqI，HindⅢ，HinfⅠ，EcorⅠ酶切，限制性內切酶Taq工酶切特異引物SCARl擴增的560特異片段具有酶切多態性，抗病品種酶切出450 bp，330 bp，290 bP的特異片段，感病品種酶切出450 bp，290bp的特異片段。初步建成番茄葉霉病高抗基因cf-9的CAPS標記，經近等基因系及其雜交種檢驗，結果穩定可靠，可用于番茄cf-9抗病基因輔助選育。

關鍵詞番茄；葉霉病；C9基因；CAPS標記

中圖分類號S 432．23

番茄是全世界產量最高的30種農作物之一，其年產量除馬鈴薯外遠遠高出其他蔬菜作物。每年由于病蟲危害，經常造成全世界番茄大面積減產。番茄生產上經常發生的病害已達40多種，其中番茄葉霉病[Fuluia fulva(Cook)]就是一種番茄生產中普遍發生的病害。葉霉病對保護地番茄生產危害尤為突出。隨著保護地番茄種植面積的擴大及連作時間的延長，該病的危害也日趨嚴重。番茄葉霉病發病率很高，此病一旦出現，迅速傳播蔓延。番茄葉霉病給番茄生產帶來了不可低估的影響。1883年，英國首次報道了番茄葉霉病的發生。從此以后，世界各國的科學工作者已對番茄葉霉病的特征特性，抗源的篩選、抗病遺傳及抗性機制等諸多方面進行了較為全面的研究。抗病基因是抗病育種的基礎，隨著生物技術的發展，人們應用遺傳圖譜和分子標記技術，對番茄抗葉霉病基因進行定位和遺傳學研究，已有多個抗性基因被克隆出來，部分基因的結構、功能和抗病機制已明確，有的已經被利用在分子育種上，這為生產上有效控制番茄葉霉病提供了一條新途徑。本文根據已發表Genbank中Cf—9基因的基因序列，創建了番茄葉霉病高抗基因Cf-9的CAPS標記，可用于番茄Cf—9抗病基因輔助選育。

1材料與方法

1．1試材

本試驗所用番茄Moneymaker、Motelle、Movi-one、Mobaci、Moperou、Mospomor、Mogeor等試材由法國農業科學院(INRA)蔬菜果樹遺傳研究所提供，它們均是以Moneymaker為遺傳背景含有不同抗病基因的近等基因系，其中對番茄葉霉病的抗性基因型詳列于表1。2000年秋，利用上述材料配制了MotelleXMovione、Mogeor×Movione和Mogeor×Motelle等3個雜交組合。LA3047是從美國番茄遺傳中心(TGRC)引入的含有CF-9基因的材料。番茄CLN2037E試材是從亞洲蔬菜研究發展中心(AVRDC)引入的含有抗晚疫病Ph-3基因的新材料，AilsaCraig是從美國番茄遺傳中心(TGRC)引入的番茄試材，92155為本組選育出的優良加工類型新品系，00383X 92155為從保加利亞遺傳研究所引入的含有雄性不育ps-2基因的新材料與本組92155雜交得到的雜種一代。

1．2引物設計

根據已發表的Cf-9基因的基因序列(GenBankaccessionnumberUl5936)，該基因全長2 867 bp，利用DNAMANversion 4．0(Primer 3．0)軟件設計特異擴增的3對PCR特異引物，擴增Cf-9基因1—2867bp之間的單拷貝片段，3對引物分別為SCARlR： ATCCAACAAGATGATTGTGAGA-GA， SCARlF： CAAACTGGTTGC,GATAC-CTATTTC；SCAR2R：ATCCAACAAGATGATT—GTGAGAGA， SCAR2F：ACTAAACCACTT-GAATGC~AGTAT；SCAR3R：GTGGTCAACT—-CAATATCCAGCA，SCAR3F：TGGTTGAGAG——GAACGAATACCT；引物序列及不同基因型材料的特異性擴增片段詳見表2。引物均由上海生物工程技術公司合成。

1．3DNA提取

所有試材播種于溫室，待幼苗長出2～3片真葉時取葉片提取DNA。提取方法參照Williamson等(1994)方法，由CTAB法提取，瓊脂糖電泳法檢測DNA濃度，然后貯備在-20℃的冰箱中備用。用于PCR反應的全部藥品購自上海普洛麥格生物技術工程有限公司。

1．4PCR擴增體系

PCR反應總體系為25μL，包括Buffer 2．5 μL、dNtPs各0．1mmol／L、Mg²⁺的濃度為1．5mmol／L、引物0．2tanol／L、Tap酶1．0U、模板DNA為20ng,終體積用水加至25μL。用于擴增含有cf9基因的PCR反應程序為：92℃變性3min然后92℃ 30s、56℃1min，72℃30s循環30次；最后72℃延伸8min，擴增產物貯藏在4℃保存。PCR產物用1．5％瓊脂糖凝膠在5v／cm電壓條件下電泳2h，終結果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統成像顯示。

1．5限制性內切酶酶切反應

1．5．1TaqI酶切反應20／μL體系，7μL PCR擴增產物、2μL bufferE，1μL TaqI(Promage)，0．2bLl％BSA，用ddH20補足體積。65‘C保溫1．5～2．0h，然后加入loadingbuffer終止反應，用1．5％瓊脂糖凝膠在5V／cm電壓條件下電泳2h，終結果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統顯示。

1．5．2HindⅢ酶切反應

20rtl體系，7μL PCR擴增產物、2 μL buff—erM，lμL HindⅢ(Promage)，0．2 μL l％BSA，用ddH₂O補足體積。37℃保溫4．0～6．0h，然后加入loading buffer終止反應，用1．5％瓊脂糖凝膠在5 V／cm電壓條件下電泳2 h，終結果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統顯示。

1．5．3HinfI酶切反應

20lμL體系，7μL PCR擴增產物、2 μL buff—err，1μL HinfI(Promage)，0．2μL 1％BSA，用ddH₂O補足體積。37℃保溫4．0～6．0h，然后加入loadingbuffer終止反應，用1．5％瓊脂糖凝膠在5v／cm電壓條件下電泳2 h，終結果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統顯示。

1．5．4EcorI酶切反應

20μL體系，7μLPCR擴增產物、2rtlbuffe—rO，l taL EcorI(Promage)，0．2 rtl 1％BSA，用ddH20補足體積。37℃保溫4．0～6．0h，然后加入loadingbuffer終止反應，用1．5％瓊脂糖凝膠在5V／cm電壓條件下電泳2 h，終結果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統顯示。

2結果與分析

2．1特異引物的擴增結果

以15個含不同抗性基因的番茄葉霉病鑒別寄主品種總基因組DNA為模板，用本研究設計并合成的3對特異引物進行PCR擴增，所有的材料分別擴增出條帶，3對引物無論是抗病材料還是感病材料分別擴增出560bp，1 000 bp，1 080 bp的特異片段，3個片段大小分別與Cf-9基因中兩對應引物之間的片段大小吻合，因此可以推斷引物設計及擴增程序是可行的，所擴增的應該是Cf-9基因或其等位基因的單拷貝片段。

2．2 Cf-9基因CAPS標記的獲得

利用限制性內切酶TaqI，HindⅢ，HinfI，Ecorl分別對該3對特異引物的擴增片段進行酶切，只有限制性內切酶TaqI酶切特異引物SCARl擴增的560 bp特異片段具有酶切多態性，而其他組合不具酶切多態性。利用SCARl正反引物擴增全部試材，無論是抗病材料還是感病材料均擴增出560 bp的特異性片斷，經TaqI酶切后(圖1a、b)，抗感病材料均存在酶切位點，其中抗病基因型LA3047抗病材料分別產生了450bp、330bp和290 bp大小的特異性片斷，而其余的感病基因型共14份材料分別產生了450 bp和290 bp大小的特異性片斷。經近等基因系及其雜交種多次檢驗，結果穩定可靠，可用于番茄Cf-9抗病基因輔助選育。

3討論

分子標記選擇是農作物分子育種的關鍵技術。在已知基因序列的情況下，要建立簡便、穩定、可靠的標記選擇體系，往往要針對基因單拷貝或低拷貝的序列進行擴增，一般情況下，抗病基因之間具有極高的同源性，抗病基因與其等位基因也具有很高的同源性，單用特異引物擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳，將難以檢測這些差異，但是同源序列間往往存在一些堿基變異，限制性內切酶可以識別單個堿基的差異，利用酶切位點的多態性即可建立抗病基因的CAPS標記。CAPS標記作為PCR和酶切技術相結合的分子標記技術，可以從單個的堿基差異進行分別，這為創建穩定可靠的共顯性標記提供了一條捷徑，在標記輔助選擇育種中具有廣闊的應用前景。

隨著染色體技術和分子標記技術用于番茄抗病基因定位以來，有關葉霉病抗性基因的遺傳及染色體定位研究取得了很大的進步。番茄葉霉病抗性受顯性單基因控制，抗病性為顯性，屬于垂直抗性，大多表現為質量性狀遺傳。Kerr和Bailey在1964年將Cf-1基因定位于番茄1號染色體。研究結果還表明，Cf-4和Cf-9基因緊密連鎖，位于1號染色體短臂上：9)，C2和Cf-5緊密連鎖，位于6號染色體臂上。Cf-1，Cf-2，Cf-4，Cf-5及Cf-9的連鎖圖可以在http：／／gerec．ifas．ufl．edu／tgc／newslet—ters／vol42／v422p19．html網址找到。CECP2被定位在1號染色體上，與Cf-4／Cf-9緊密連鎖。1980年Kanwar等把所有24個抗葉霉病基因已全部定位于番茄12條不同的染色體，對這24個基因在染色體上的定位及分離仍在繼續進行。其中Cf-10，Cf-16，Cf-12，Cf-21這4個基因在染色體上的位點又有了新的變更。隨著AFLP技術的出現，Thomas等用BSA(bulked segregant analysis)方法，利用番茄與野生種勻copersiconpennellii種間雜交F，群體發現42 000條AFLP帶與番茄抗葉霉菌基因Cf-9緊密連鎖，其中3個標記(M1，M2，Ma)與Cf-9基因表現共分離。Laugh等發現在Cf-9基因片斷附近還存在一個甚至數個對葉霉病表現抗性的基因，但抗病性比Cf-9弱，這可能是Cf-9基因至今仍未被葉霉病病原菌克服的原因。1993年Cf-9基因被克隆，這一成果為本研究CAPS標記的建立奠定了基礎。本研究利用Cf-9基因的Gen—bank基因序列創制分子標記，所獲得的CAPS標記與抗病基因共分離，選擇的穩定性與可靠性將明顯優于前者，這將為Cf-9基因的分子標記輔助育苗提供高效選擇手段。