鉤藤種子無菌萌發及植株再生培養體系研究

關鍵詞：鉤藤;叢生芽;壯苗生根;組織培養

鉤藤，茜草科鉤藤屬，別名鉤丁、鷹爪風、倒掛刺等，是一種常綠藤本植物;莖枝呈圓柱形或類方柱形，有細縱紋;節卜生有向下彎曲的雙鉤或單鉤，鉤下有托葉痕;質硬，莖斷面有黃白色髓部;鉤藤及同屬多種植物以帶鉤的莖枝人藥。現代中醫藥研究表明，鉤藤還可以用于治療缺血性中風、腦血管疾病和帕金森病等多種疾病，還具有改善微循環的作用。隨著鉤藤的廣泛使用，市場對其需求加大，引起掠奪性采收，導致野生鉤藤資源大量減少，現有野生資源已不能滿足需求，因此鉤藤的人工種植成為必然選擇。目前國內規模種植鉤藤的有貴州省劍河縣和湖南省懷化市等，其中劍河縣鉤藤的種植規模有0.8hm2，已形成初步產業。

目前，關于鉤藤組織培養的研究在多個方面開展，如毛堂芬等、龍祥友等、施力軍等、吳順對鉤藤的組織培養研究，羅鳴等對鉤藤育苗比較試驗研究，均取得一定的成果，為鉤藤產業發展提供了諸多參考，也為本文的研究奠定了前期基礎。本研究通過開展鉤藤多因素多水平擴繁正交試驗，優化鉤藤組織培養配方，旨在為鉤藤人工種植的產業化育苗提供參考。

1材料和方法

1.1試驗材料

鉤藤種子采集于廣西壯族自治區羅城仫佬族自治縣青明山林場內（東經108'54 753”88，北緯24'59'50\"13）。

培養基配方：市售MS培養基，瓊脂5.3g-L-1，蔗糖30g-L-1，酸堿度調整至pH6.8，其中液體培養基不添加瓊脂。

1.2試驗設計

本研究所涉及試驗的培養室條件均為培養溫度（25±2）℃，光照時間10h.d-1，光照強度為30001x。

1.2.1誘導種子無菌萌發選取成熟飽滿、色澤好且未開裂的鉤藤蒴果，先用70%的乙醇進行表面消毒1min，用無菌水沖洗1次，再用0.1%的HgCl2溶液加適量吐溫80浸泡8min，最后用無菌水沖洗3-4次。隨后以滅菌后的濾紙吸干蒴果表面卜的水分，用兀菌的解剖刀切開蒴果，將種子撒播在種了萌發培養基（MS+NAA 0.2 mg.L-1+6-BA 2.0mg·L-1+GA3 0.5mg-L-1+活性炭0.1%）上。經過10d的培養室培養，種子開始萌發，定期觀察其生長情況。

1.2.2無菌苗的擴大繁殖

待種子萌發長到4-6cm時，剪掉葉予，修剪成1.5-2.0cm長的帶腋芽的小莖段分別斜捕于試驗設計的10種叢生芽誘導培養基（表1）中進行擴大繁殖，每個培養基接種3株，每個處理接種10瓶作為重復。培養室培養30d后，觀察記錄叢生芽生長情況。再用擴繁效果好的培養基進行再次擴大繁殖，以獲得大量的試驗材料。

1.2.3壯苗生根正交試驗

為分析各個因素對鉤藤生根生長的影響之間的差異，試驗采用L16正交試驗設計（表2）。取株高約為5-8cm的生長良好單株，剪成每段約2-3cm，帶兩個芽點，轉接至不同激素組合及培養基配方的培養基中進行培養，每瓶接種3棵苗株，每個組合接種10瓶作為重復。每5d進行一次觀察，45d后對植株的生長狀況進行統計分析。

2結果與分析

2.1鉤藤種子的無菌萌發

本試驗在前人研究基礎卜選用0.1%HgCl2溶液對鉤藤滅菌8min，結果種了污染率20%，未污染的種子在種子萌發培養基（MS+NAA0.2 mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+GA30.5 mg' L-1+活性炭0.1%）中萌發率達到40%，獲得的兀菌苗能滿足下一步試驗的需要。

2.2擴繁過程中不同培養基對鉤藤叢生芽生長的影響

不同培養基配方影響鉤藤叢生芽的誘導。最佳培養基為T6，即MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg.L-1+硫代硫酸鈉0.3mg.L-1+活性炭0.1%，叢生芽率（40%）和存活率（66.7%）均最高;接種3d后，未添加活性炭的T9培養基植株切口基部腫大出現白色疏松的愈傷，不長根，且長勢較差，而對比添加0.1%活性炭的T10培養基植株，3d后開始生根，且葉深綠，長勢較好。

2.3不同激素的濃度配比對鉤藤壯苗和生根的影響

由表4和表5可知，過高或過低濃度的NAA和6-BA均不利于鉤藤生長。正交試驗的16個處理中，第6種培養基中NAA濃度為0.1mg-L-1和6-BA濃度為1.0 mg.L-1組合處理后壯苗效果比較好，卟子顏色深綠，莖段粗，植株高，平均株高為8.0cm，生根率90%，平均根長12.0cm;其他處理中部分植株生根情況不理想，部分植株出現褐化現象，但大部分植株生長良好，葉子深綠，根變得更長更壯，植株高度增加。

由正交試驗的極差分析結果（表5）可知，鉤藤平均株高和平均根長的影響因素表現為NAAgt;IBAgt;6-BA，而生根率的影響因素表現為6-BAgt;NAAgt;IBA，但根據三個指標選擇的優水平均為A2B3C2的組合，即為MS+NAA0.1mg·L-1+6-BA1.5mg.L-1+IBA0.4 mg·L-1，這與16個處理中的最佳處理NAA濃度為0.1mg-L-1和6-BA濃度為1.0mg-L-1組合（第6種培養基）不一致，故開展驗證試驗，配制上述最優組合培養基，每瓶接種3株苗，每個組合接種10瓶，重復3次，培養45d后統計數據。此時生根率為93%，平均株高為9.0cm，平均根長為12.7Cm。驗證試驗結果表明，A2B3C2組合壯苗生根效果最佳。

3結論與討論

我國對鉤藤的關注度較高，鉤藤研究在近年也最為迅速，豐要集中在臨床和藥理作用方面，而對其栽培、加工、組織培養等研究較少。隨著現代醫學的發展，鉤藤的需求更加大，隨著對鉤藤的有效成份鉤藤總堿的研究日益深入，鉤藤堿的提取方法日益成熟，筆者認為應加大對鉤藤的育苗、種植、深加工和銷售產業鏈的研究。采用組織培養技術對鉤藤的人工栽培和種質資源保護有熏要的支撐價值。

日前，在鉤藤的組織培養研究多用種子無菌萌發的方式進行，兇為鉤藤的種子細小不易攜帶病毒，較之于莖芽更容易滅菌消毒，所以本試驗以種了作為外植體;本試驗使用的是MS培養基與毛堂芬等所用的基礎培養基（B5）不同，增殖和生根培養所用的激素配比也不同，腋芽增殖率和生根率相近，說明了銨鹽對鉤藤組織培養的影響不太;與吳順等所用的基礎培養基（WPM）不同、外植體不同，其豐要以鉤藤幼嫩葉片、嫩枝和嫩莖等部位來誘導愈傷組織的形成和分化，嘗試用MS或B5作為基礎培養基通過誘導愈傷形成的方式進行研究，值得進一步探討。施力軍等，在誘導生根方面以1/2MS培養基+NAA 2.0mg.L-1+活性炭0.03%為最佳生根培養基，用量與本試驗有所不同，但都證明一定濃度范圍內的NAA和活性炭有助于鉤藤的生根。以1/2MS為基礎進行NAA濃度梯度試驗分析，值得進一步研究。

綜上，試驗比較了不同激素的濃度配比對鉤藤叢生芽、壯苗和生根的影響。結果發現，用0.1%HgCl2溶液對鉤藤種子進行滅菌，滅菌時間為8min效果較好。不同激素不同比例能影響鉤藤的叢生芽誘導、壯苗和生根，其中叢生芽誘導最佳的培養基是：MS+6-BA1.0mg.L-1+NAAO.1mg.L-1+硫代硫酸鈉0.3mg-L-1+活性炭0.1%，叢生芽最高可達40%，在培養基中添加0.1%活性炭有利于促進鉤藤叢生芽的生長與生根，壯苗生根效果最佳的組合是MS+NAA 0.1mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1+IBA0.4mg·L-1+活性炭0.1%，生根率為93%，平均株高為9.0cm，半均根長為12.7cm，葉色深綠，莖段粗壯。