血管緊張素Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶活性的影響

[摘要]目的：本研究觀察血管緊張素Ⅱ(angiotens in Ⅱ，Ang Ⅱ)對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal－regulated kinase，ERK)活性的影響，旨在探討其影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的信號機制。方法：取自愿捐獻的增生性瘢痕組織標(biāo)本，采用膠原酶法行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。用免疫熒光組織化學(xué)法檢測細(xì)胞AT1和AT2受體的表達。取第3－4代細(xì)胞，并按實驗設(shè)計，分別加入10^-2Tmol/L Ang Ⅱ，10^-2mol/L Ang Ⅱ+10 μmol/L Valsartan，10^-2mol/L Ang Ⅱ+10μ ol/L PDl23319，10~mol/L Val sartan，10μmol/L PDl2 3319共5組；對照組僅加入等量DMEM。以Western Blot法檢測培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ext racellular signal－regulated kinases，ERK)活性變化，觀察在阻斷AT1或AT2受體情況下Ang Ⅱ?qū)ε囵B(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化的影響。結(jié)果：免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞同表達AT1和AT2受體。Ang Ⅱ可增加培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化。在一定劑量范圍內(nèi)，Ang Ⅱ濃度增加，細(xì)胞ERK磷酸化程度增加。與對照組比較10^-7mol/L Ang Ⅱ顯著增加瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。10μmol/L AT2受體拮抗劑PDl233191可顯著增強Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受體拮抗劑Val sartan可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化；Valsartan或PD1233191單獨刺激細(xì)胞并未明顯影響ERK磷酸化(P＞0.05)。應(yīng)用抗ERK抗體顯示各組ERK含量一致。結(jié)論：Ang Ⅱ通過其受體AT1和AT2可調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞ERK活性的影響可能是Ang Ⅱ調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為可能的信號機制之一。

[關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅱ；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；受體

[中圖分類號]R619.6 R364.3 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0874－04

研究表明，許多細(xì)胞因子在瘢痕形成中可改變在創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用的成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，引起組織細(xì)胞對損傷的過度反應(yīng)，導(dǎo)致瘢痕過度增生。因此研究細(xì)胞因子對成纖維細(xì)胞增殖、分化、演變及凋亡的調(diào)控，是目前研究增生性瘢痕形成機制的熱門課題。最新的研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是一個重要的致纖維化因子，且與皮膚的纖維增殖性病變有密切關(guān)系。我們最近也報道了Ang Ⅱ可促進增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成，然而其影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的信號機制尚未闡明。本研究我們采用體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察Ang Ⅱ?qū)?xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性的影響，旨在探討其作用的分子機制。

1 材料和方法

1．1 主要材料和試劑：實驗所需增生性瘢痕組織標(biāo)本取自我科住院患者手術(shù)切除的增生性瘢痕組織。增生性瘢痕形成不超過一年，取材部位未經(jīng)任何治療，不伴有腫瘤或其他結(jié)締組織疾病。未曾服用抑制血管緊張素系統(tǒng)的藥物。

DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(日本W(wǎng)ako公司)，Dispase(日本Sanko公司)。AT1受體阻斷劑Valsartan，AT2受體拮抗劑PDl2339(日本三共公司)，抗細(xì)胞外信號激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)和pERK的抗體，兔抗人ATl受體多克隆抗體，羊抗人AT2受體多克隆抗體均購自Santa Cruz公司。德克薩斯紅(Dexas Red)標(biāo)記的鼠抗兔IgG，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗羊IgG均由第四軍醫(yī)大學(xué)全軍神經(jīng)科學(xué)研究所提供。

1．2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：應(yīng)用膠原酶法行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，用0.125％的胰蛋白酶消化傳代。實驗所用成纖維細(xì)胞為第3－4代。

1．3 免疫熒光組織化學(xué)檢測AT1和AT2受體表達：利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中AT1和AT2受體表達情況。操作按試劑盒說明進行，將培養(yǎng)的細(xì)胞用40g/L多聚甲醛固定10min，PBS緩沖液洗滌，1％BSA封閉30min，分別加入工作濃度為1:50的相應(yīng)抗體，4 ℃下保持在濕盒中孵育36h。洗滌后，加入兩種熒光素混合液(工作濃度分別為FITC標(biāo)記1:30，得克薩斯紅標(biāo)記1:100)，室溫孵育3h。經(jīng)得克薩斯紅標(biāo)記后，AT1受體呈紅色熒光(激發(fā)波長514nm)，F(xiàn)ITC標(biāo)記后，AT2受體呈綠色熒光(激發(fā)波長488nm)當(dāng)細(xì)胞同時標(biāo)記到兩種熒光素時則表現(xiàn)為黃色熒光。通過計算機采集共聚焦顯微鏡所得圖像。

1．4 實驗分組：選擇生長狀態(tài)良好3－4代的成纖維細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，無血清培養(yǎng)，實驗組分為5組，并按實驗設(shè)計分別加入10^-7mol/L Ang Ⅱ，10^-7mol/L Ang Ⅱ+10pμmol/L Valsartan，10^-7mol/L Ang Ⅱ+10μmol/L PDl23319，10μmol/L Valsartan，10μmol/L PD123319，對照組僅加入等量的DMEM。于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1．5 Western blot分析細(xì)胞外信號激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性：取各組細(xì)胞按試劑盒說明書操作。具體方法如下：實驗終點取細(xì)胞溶解物、離心、提取總蛋白。取25μg蛋白，變性后上樣于10％的聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入一抗即：抗ERK或pERK的抗體(工作濃度1:1000)，加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗，ECL化學(xué)法光試劑盒檢測信號。通過美國NIH圖像分析系統(tǒng)(美國國家衛(wèi)生研究院研究服務(wù)中心)，對各條帶的灰度值進行測定比較。每次實驗重復(fù)3次。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，統(tǒng)計處理應(yīng)用SPSS軟件，組間比較采用方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ang Ⅱ受體AT1和AT2的表達：對培養(yǎng)的3－4代的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞免疫熒光組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞同時表達AT1和AT2受體，陽性標(biāo)記主要位于細(xì)胞膜。AT1受體的陽性標(biāo)記似乎較AT2受體陽性標(biāo)記強。

2．2 Ang Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞ERK磷酸化的影響：在無血清培養(yǎng)的條件下，AngⅡ(10^-6mol/L)的刺激引起培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化增加，在Ang Ⅱ刺激后5min，ERK磷酸化程度達到峰值。在一定劑量范圍內(nèi)，刺激物Ang Ⅱ濃度增加，細(xì)胞ERK磷酸化程度增加

2．3 AT1和AT2受體在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化中的作用：與對照組比較，1×10^-7mol/L Ang Ⅱ顯著增加成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。10μmol/L AT2受體拮抗劑PD1233191與10^-7mol/L Ang Ⅱ同時刺激成纖維細(xì)胞，PD123319l可顯著增強Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化，與單純Ang Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受體拮抗劑Valsartan與10^-7mol/L Ang Ⅱ同時刺激細(xì)胞，Valsartan可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化，與單純Ang Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；Valsartan或PD1233191單獨刺激細(xì)胞并未明顯影響ERK磷酸化，應(yīng)用抗ERK抗體顯示各組ERK含量一致。

3 討論

增生性瘢痕主要病理表現(xiàn)是成纖維細(xì)胞異常過度增殖、細(xì)胞膠原代謝異常導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，其形成機制尚未完全闡明。目前研究已證明，細(xì)胞因子在瘢痕形成中起著重要作用。腎素一血管緊張素系統(tǒng)最重要的活性產(chǎn)物Ang Ⅱ作為一個重要的應(yīng)激激素和多效應(yīng)生長因子不僅在心血管和腎臟的纖維化病變中起重要作用，而且與皮膚的瘢痕形成和成熟關(guān)系密切。我們也曾報道了Ang Ⅱ通過其受體調(diào)節(jié)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為。然而其作用的細(xì)胞信號機制仍未闡明。ERK是哺乳類動物和無脊柱動物細(xì)胞中最早發(fā)現(xiàn)的絲裂素激活蛋白激酶家族的核心成員，是目前研究比較清楚的刺激轉(zhuǎn)錄增加的一條通路。該通路最主要的激活信號來自生長因子，通過改變靶蛋白的磷酸化在細(xì)胞生長、遷移及分化等信號傳遞中起重要作用。多種細(xì)胞因子包括Ang Ⅱ通過其受體可激活ERK，導(dǎo)致幾個早期即刻基因c－fos、c－jun、erl－1等表達增加。陳偉等報道在增生性瘢痕組織中磷酸化ERK表達增加。劉傳君等報道瘢痕疙瘩的成纖維細(xì)胞和正常皮膚的成纖維細(xì)胞ERK磷酸化程度明顯不同陽。上述發(fā)現(xiàn)提示ERK通路的改變可能與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為改變有關(guān)。為進一步探索Ang Ⅱ影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機制，本研究以觀察Ang Ⅱ?qū)︸：鄢衫w維細(xì)胞ERK活性的影響為切入點，試圖初步闡明其作用可能的信號機制。

本實驗首先觀察了Ang Ⅱ受體在培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達。免疫熒光組織化學(xué)的檢測結(jié)果顯示增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞同表達AT1和AT2受體蛋白，這個結(jié)果再次證實我們以前的發(fā)現(xiàn)。為弄清Ang Ⅱ如何調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK的磷酸化，我們用藥理學(xué)受體阻斷的方法觀察了Ang Ⅱ受體AT1和AT2在成纖維細(xì)胞ERK磷酸化中的作用。本實驗我們發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ刺激可增加人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，用選擇性AT1受體阻斷劑Valsartan阻斷AT1受體可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，用AT2受體拈抗劑PD123319阻斷AT2受體可促進細(xì)胞ERK磷酸化，AT1受體介導(dǎo)的Ang Ⅱ的促牛長信號受到AT2受體否定的調(diào)控，這個實驗結(jié)果提示：AngⅡ通過其受體AT1和AT2可調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ?qū)Τ衫w維細(xì)胞ERK活性的影響可能是Ang Ⅱ調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為町能的信號機制之一。

已證實正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為存在明顯差異，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕中Ang Ⅱ產(chǎn)生增加，AT1和AT2受體表達增加，而且Ang Ⅱ產(chǎn)生和受體表達的變化趨勢與瘢痕的成熟過程密切相關(guān)。我們現(xiàn)在的研究再次證實，Ang Ⅱ作為一個致纖維化因子不僅在心血管系統(tǒng)起作用，同時也在皮膚瘢痕形成中起作用，同時提示Ang Ⅱ?qū)?xì)胞內(nèi)的信號分子如ERK活性的調(diào)控可能是其影響增生性瘢痕形成可能的信號機制之一。這種調(diào)控作用可能是通過Ang Ⅱ產(chǎn)生量及其受體AT1和AT2表達量和表達比例的變化來實現(xiàn)的，通過抑制Ang Ⅱ產(chǎn)生、阻滯AT1受體或激活A(yù)T2受體，可導(dǎo)致下游信號通路，如ERK通路阻滯，可能對增生性瘢痕產(chǎn)生抑制作用，從而加快瘢痕的成熟。進一步研究需要在體內(nèi)實驗條件下驗證上述可能的推測。

另外，神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌在組織修復(fù)中的作用已引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。皮膚是一個激素敏感器官，義是Ang Ⅱ作用的靶器官之一。Ang Ⅱ作為細(xì)胞因了在局部組織起作用，同時也作為全身重要的幾個激素系統(tǒng)中的一個發(fā)揮生理作用，它在機體組織損傷后的重建過程中的作用及其作用的信號機制是非常復(fù)雜的，需要在今后的研究中進一步深入探討并加以揭示。

綜上所述，本實驗證實增生性瘢痕成纖維細(xì)胞同表達Ang Ⅱ受體蛋白AT1和AT2，Ang Ⅱ通過激活A(yù)T1和AT2受體對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK的磷酸化產(chǎn)生相反的調(diào)控作用，進而可能影響成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。目前AT1受體阻斷劑已商品化，并廣泛用于心血管疾病的治療，供藥理學(xué)研究使用的AT2受體拮抗劑也已開發(fā)成功，現(xiàn)在的研究有可能為此類藥物用于瘢痕的治療或開發(fā)新的抗瘢痕藥物提供線索。