強脈沖光對培養(yǎng)的人成纖維細胞表達ＭＭＰ－１和ＴＩＭＰ－１的影響

[摘要]目的：觀察強脈沖光照射對體外培養(yǎng)的成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)的影響，探討IPL嫩膚作用的分子生物學機制。方法：采用能量密度分別為20、25、30J/cm²的強脈沖光對培養(yǎng)的人成纖維細胞進行照射，于照射后24h及48h應(yīng)用ELISA法測定上清液中MMP-1和TIMP-1的表達并與對照組比較。結(jié)果：照射24h后25及30J/cm²組上清液中檢測到的MMP-1、TIMP-1含量輕度升高；48h時各能量組MMP-1均升高，但各組間并無顯著性差異。TIMP-1隨能量的升高而含量增高。結(jié)論：強脈沖光照射成纖維細胞后可引起MMP-1，TIMP-1表達的增加，但是TIMP-1的增加遠遠大于MMP-1的增加，提示IPL嫩膚作用的生物學機制可能與成纖維細胞產(chǎn)生的TIMP-1增加有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]強脈沖光；成纖維細胞；MMP-1；TIMP-1

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0885－03

細胞外基質(zhì)(extracellular mattix，ECM)在維持正常組織與功能及細胞生長、分化過程中起著非常蓖要的作用，它處于不斷新陳代謝、降解重塑的動態(tài)平衡中。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal－loproteiEases，MMP)是降解ECM的重要酶類，幾乎能降解細胞外基質(zhì)的所有成分。而組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metallopro－teiEase，TIMP)是MMP的天然抑制物，是一組能抑制MMP活性的多功能因子。MMP和TIMP之間的平衡關(guān)系在調(diào)節(jié)ECM的穩(wěn)定中有重要作用。

臨床實踐證明強脈沖光(IPL)可有效改善面部皮膚光老化，但生物學機制尚不完全清楚。據(jù)文獻報道IPL通過光熱解效應(yīng)對組織產(chǎn)生一定程度熱損傷而啟動損傷修復機制達到組織重塑的目的，但在對組織修復機制的研究中，MMP-1和TIMP-1在其中作用的研究報道少見。據(jù)此，本實驗觀察IPL作用于培養(yǎng)的人成纖維細胞后，上清液中表達MMP-1和TIMP-l動態(tài)變化的影響，從蛋白水平研究IPL在治療皮膚光老化過程中MMP-1和TIMP-l所起的作用，以探討強脈沖光(IPL)治療作用的生物學機制。

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材料和方法

1．1 試驗儀器：IPL Quantum SR光子嫩膚儀(Lume－nis公司)，臺式高速離心機，恒溫水浴箱，酶標儀(美國450型酶聯(lián)檢測儀)。

1．2 細胞準備及實驗分組

1．2．1 成纖維細胞培養(yǎng)：取正常兒童包皮組織，應(yīng)用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)，培養(yǎng)成功后傳代培養(yǎng)，試驗時用第三代至第五代細胞。

1．2．2 實驗分組

1．2．2．1 實驗分組：對照組為空白，實驗組照射參數(shù)參照臨床常用治療參數(shù)，即波長選擇為560－1200nm脈沖類型為雙脈沖，脈寬為34ms(第一子脈沖3.0ms，延遲25ms，第二脈沖6.0ms)，分為三組，能量密度分別為20J/cm²，25j/cm²，30J/cm²。

1．2．2．2 樣品準備：①每孔2×10⁵個細胞接種于3.5cm培養(yǎng)板中，細胞生長至亞融合時給予IPL照射。將亞融合狀態(tài)的培養(yǎng)細胞分為照光組(6個)和對照組(1個)，每次共7皿，實驗獨立重復4次。照射前細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)換液，使PBS剛好覆蓋細胞，室內(nèi)消毒1h，槍頭用75％酒精擦拭，采用Quantum SR光子嫩膚儀，每個培養(yǎng)皿照射5次， 能量密度分別為20j/cm²，25J/cm²，30j/cm²，每組能量兩個培養(yǎng)皿。照射后棄去覆蓋液PBS，在成纖維細胞中加入DMEM培養(yǎng)基，并全部放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，對照組除未給予IPL照射外，其余與照光組處理相同。②24h及48h后分別收集培養(yǎng)液的上清液置Ep管中，放置于-20℃冰箱冷藏備用。

1．3 上清液中MMP-1和TIMP-1的檢測：采用雙抗體夾心ABC－ELISA法，在492nm處測OD值，MMP－1濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中MMP-1濃度。人TIMP-1酶聯(lián)免疫測定步驟及結(jié)果判斷同上。

1．4 統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)采用x ±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，q檢驗及t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

在體外培養(yǎng)的成纖維細胞分別用20J/cm²，25J/cm²，30J/cm²IPL照射，24h及48h后上清液檢測MMP-1和TIMP-1表達。

2．1 IPL照射后體外培養(yǎng)的成纖維細胞上清液檢測MMP-1：在培養(yǎng)24h后上清液檢測MMP-1，與對照相比檢測到的MMP-1在20J/cm²組沒有變化，25j/cm²，30j/cm²組MMP-1含量升高。方差分析顯示，F(xiàn)=5.812，P＜0.05，q檢驗顯示，24h－MMP對照組1與2，2與3，3與4之間相比無顯著性差異(P＞0.05)，余各組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。培養(yǎng)48h后上清液檢測MMP-1，與對照相比上清液中檢測到的各組MMP-1含量均增高，但MMP-1并不隨照射能量增加而升高。方差分析顯示，F(xiàn)＝10.614，P＜0.01，q檢驗顯示，48h-MMP時2與3，2與4，3與4之間相比無顯著性差異(P＞0.01)，余各組相比均有顯著性差異(P＜O.01)。

2．2 IPL照射后體外培養(yǎng)的成纖維細胞上清液檢測TIMP-1：培養(yǎng)24h后上清液檢測TIMP-1，與對照相比上清液中檢測到的TIMP-1在20J/cm²亦無變化，而25J/cm²，30J/cm²組TIMP-1含量升高。方差分析顯示，F(xiàn)＝8.074，P＜0.01；q檢驗顯示，24h-TIMP時對照組1與2，2與3，3與4之間相比無顯著性差異(P＞0.01)，余各組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。培養(yǎng)48h后上清液檢測TIMP-1，與對照組相比上清液中檢測到的TIMP-1隨能量增加，而TIMP-1含量升高。方差分析顯示，F(xiàn)＝259.464，P(0.01；q檢驗顯示，48h－TIMP時各組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。

2．3 各能量組不同時間之間MMP-1與TIMP-1含量的t檢驗：各能量組之間MMP-1含量的變化并不隨時間推移而增加。各能量組之間TIMP-1含量的變化隨時間推移而明顯增加。

3 討論

強脈沖光(IPL)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的治療皮膚光老化的一種新方法，其波長為＞500nm的非相干紅光和紅外光，因此可以透過表皮穿透到真皮和皮下組織。臨床實踐已證實能有效改善皮膚色素增加性病變和血管性增生性病變，同時能改善皮膚的質(zhì)地、細小皺紋。Negishi等對治療后患者皮膚行免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，強脈沖光不僅增加Ⅰ型膠原合成，而且也增加Ⅲ型膠原合成。Raulin等認為，IPL通過選擇性光熱解作用，導致膠原損傷，啟動損傷修復過程使膠原含量增加。近年來在研究有關(guān)ECM合成和降解的代謝平衡調(diào)解中，MMP和TIMP兩個酶系統(tǒng)的作用引人注目。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)26種MMP，稱為MMP家族。MMP能通過破壞基質(zhì)的降解平衡而促進腫瘤細胞突破基底膜和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織屏障作用，從而侵襲周圍組織。MMP的表達在未受刺激的細胞中較低，但是部分在各種細胞外刺激因素誘導下(包括生長因子，細胞因子腫瘤促進劑，紫外線和紅外線輻射)，含量升高。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metal-loproteinase，TIMP)是MMP的天然抑制物，是一組能抑制MMP活性的多功能因子。TIMP是阻斷ECM降解，抑制MMP活性的一組分泌糖蛋白，它參與組織結(jié)構(gòu)的建立與維持，可間接影響依賴ECM進行的細胞信號傳遞，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TIMP有4個家庭成員。TIMP-1可由多種細胞分泌，它可優(yōu)先抑制MMP-1。

目前有關(guān)IPL引起皮膚熱損傷修復機制的研究中，對MMP和TIMP的作用研究報道較少。王明利等曾觀察過強脈沖光(IPL)對大鼠皮膚MMP-1和TIMP-1表達的影響，結(jié)果在照射大鼠皮膚后，第1天MMP-1即見表達，第7天表達至高峰，第15天表達開始減弱，而第1天TIMP-1無表達，第3天出現(xiàn)表達并逐漸增強，第15天時達到高峰。本實驗顯示，亞融合狀態(tài)的成纖維細胞在分別接受20J/cm²、25J/cm²、30J/cm²強脈沖光照射后，在培養(yǎng)24h后20J/cm²組上清液未檢測MMP-1及TIMP-1變化，而25J/cm²、30J/cm²組MMP-1和TIMP-l含量輕度升高。在培養(yǎng)48h后則各能量組MMP-1均增高，但并不隨照射能量增加而升高。然而，在培養(yǎng)48h后發(fā)現(xiàn)TIMP-1隨IPL照射能量增加而含量升高，并且各組相比均有顯著性差異，表明在IPL照射后早期MMP-1和TIMP-1二者升高幅度無差別，而照射后48h則各能量組TIMP-1均明顯較MMP-l含量增高。這一結(jié)果與王明利等的研究結(jié)果有一定差異，可能是因為作用的對象以及檢測的方法和時間不同而有差異。

基于TIMP的功能，本實驗結(jié)果表明IPL對組織熱損傷的修復和重塑作用在照射后48h開始啟動并與照射能量成正相關(guān)，提示IPL嫩膚作用的生物學機制可能與成纖維細胞產(chǎn)生的TIMP-1增加有關(guān)。