豬皮膚撕脫傷ＣＤ１８的表達與組織繼發性壞死的研究

[摘要]目的：研究豬皮膚撕脫傷組織中整合素CD18的表達及中性粒細胞的趨化，探討CD18在皮膚撕脫傷組織繼發性壞死中的作用。方法：復制豬皮膚撕脫傷模型，采用RT-PCR方法檢測傷后不同時間撕脫組織中CD18mRNA的表達；用髓過氧化酶(MyeloperoxidaBe enzyme，MPO)法測定組織中中性粒細胞數量，研究傷后撕脫組織中中性粒細胞的趨化情況。結果： ①傷后撕脫組織中CD18mRNA的表達逐漸升高，12h達峰值，24h后有所下降，受傷2h后各時間點實驗組CD18mRNA的表達明顯高于對照組（P<0.05）。 ②MPO傷后2h開始升高，12h達峰值，24h無明顯下降趨勢， 受傷2h后實驗組各時間點MPO活性明顯高于對照組（P<0.01）。結論： 皮膚撕脫傷傷后早期組織中整合素CD18呈高表達，其變化與組織中中性粒細胞的趨化呈正相關，提示CD18在皮膚撕脫傷早期組織繼發性壞死中可能發揮了重要作用。

[關鍵詞]皮膚撕脫傷；CD18；中性粒細胞；髓過氧化酶

[中圖分類號]R619.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）09-1175-03

The expression of CD18 and tissues secondary necrosis in skin avulsion injure of swine

Song Bao-qiang1，Guo Shu-zhong1，HU Ya-lan2，Han Yan1，LI Yu3

(1.Institute of Plastic Surgery of Chinese PLA，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Department of Plastic Surgery，260 Hospital，the Bethune Military Medical College，Shijiazhuang 050041，Hubei，China;3.Department of Pathology，the Fourth Military Medical University.)

Abstract: Objective To investigate the expression of CD18 and the tendency of neutrophil in avulsed skin tissues of swine， and to discuss the effect of CD18 on secondary tissues necrosis of skin avulsion injury. Methods The animal model of skin avulsion injury was replicated， and the expression of CD18mRNA in avulsed skin tissues was detected by RT-PCR method; and the amount of neutrophilic granulocyte in tissues was detected by MPO method in order to analyze the tendency of neutrophil of avulsed tissues after trauma.Results①The expression of CD18mRNA in avulsed tissues after trauma gradually increased， reached its peak value at the 12th hour， and then decreased slightly in the following 12 hours. The relative value of CD18mRNA of avulsed skin tissues in experiment group was markedly higher than that in control group at the different time after 2nd hour of trauma（P<0.05）. ②The activity of MPO in avulsed skin tissues in experiment group began to rise at the 2nd hour after trauma， and reached its peak value at 12th hour. No obvious decline occurred in the following 12 hours. The activity of MPO in experiment group was obviously higher than that in control group at the different time after 2nd hour of trauma（P<0.01）.ConclusionThe expression of CD18 in tissues is high during the early period of skin avulsion injury and its change is in positive correlation with the tendency of Neutrophil in tissues. It should be pointed out that CD18 may act an important role in secondary tissue necrosis of skin avulsion injury at the early stage.

Key words: skin avulsion injury; CD18; neutrophil; myeloperoxidase

皮膚撕脫傷是整形外科常見創傷，其組織繼發性壞死機制的研究是該類損傷基礎研究的重點。近些年的研究發現，粘附分子在皮瓣的缺血再灌注損傷中發揮著重要的作用，其中CD18所介導在中性粒細胞損傷在其中扮演了重要的角色[1-2]。由于皮膚撕脫傷傷后存在缺血再灌注的病理生理過程，因而CD18在撕脫傷中的作用也是我們關心的問題之一。本研究擬通過對受傷組織中CD18的表達及中性粒細胞趨化的研究，探討粘附分子CD18在皮膚撕脫傷組織繼發性壞死中的作用。

1材料和方法

1.1 實驗動物及分組：選擇檢疫后的白色小豬作為實驗動物，共14頭，其中雌性6頭，雄性8頭，體重15～25kg，人工混合飼料喂養。將14頭小豬隨機分成實驗組和對照組，每組7頭。

1.2 皮膚撕脫傷模型的復制及標本的采集：實驗組動物經3%戊巴比妥鈉30mg/kg肌注麻醉后，豬后肢外側預撕脫部位備皮，將其固定于撕脫傷模型機上，按文獻[3]報道的參數復制皮膚撕脫傷。隨即將遭受創傷的小豬固定于手術臺上，常規消毒鋪巾，用美藍于豬后肢撕脫區域設計一12cm×4cm的蒂在近端的任意型皮瓣，沿設計線切開皮膚、皮下，于深筋膜下掀起皮瓣，隨后再將其原位縫回。術后0、2、6、12、24h于皮瓣的中遠1/3交界處采集組織標本。對照組動物不經模型機碾壓，直接于豬后肢通過手術形成一12cm×4cm的蒂在近端的任意型皮瓣，術后0、2、6、12、24h于皮瓣中遠1/3交界處采集組織標本。

1.3 組織中CD18mRNA的表達：采用RT-PCR 法檢測組織標本中CD18mRNA的表達，用 Trizol 試劑（Gibco-BRL公司）分別提取實驗組和對照組組織標本中的總 RNA，用隨機引物將其反轉錄成 cDNA 后進行 PCR 擴增，并以β-Actin為內對照。其中擴增CD18基因的上游引物為5' TTTAgAAgAACAACCCgTgC 3'；下游引物為：5' TgTTgATgCTggACgTgCAC 3'；PCR 條件為：94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s，30個循環。反轉錄按照試劑盒（Promega公司）提供的說明書進行，其中CD18的擴增片斷為500bp，β-Actin的擴增片斷為250bp， 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，用UVP凝膠成像系統進行檢測，并用Labworks軟件對各陽性條帶的密度進行測定。利用PCR膠回收試劑盒（上海華舜生物技術公司）將PCR產物從凝膠上收回，進一步亞克隆至PMD18-T載體，經轉化JM109感受態細胞、篩選、小量制備質粒DNA后，用Sanger雙脫氧鏈終止法及測序試劑盒(Amer-sham)進行序列測定。

1.4 組織中MPO活性測定：取撕脫組織0.1g，加入0.5%溴代十六烷基三甲胺（Sigma公司）溶液2ml，用勻漿機（德國ART公司）勻漿。超聲細胞粉碎儀（英國SANYO MSE公司），（10s、3次）粉碎細胞及亞細胞成分。0～4℃，40000g離心15min。取上清0.1ml加反應液2.9ml（磷酸鄰聯茴香胺16.7mg，50mmol/LPBS液10ml，蒸餾水90ml，加入30%過氧化氫，使最終濃度為0.0005%），分光光度計（HITACHI公司）460μm波長下立即進行2min掃描。以第30s至90s 1min時間內吸光度(OD值)的變化代表酶活力的改變。根據下列公式計算MPO活性單位（25°C下，每分鐘分解1μmolH2O2的MPO的量為1個MPO活性單位)，以反映組織中中性粒細胞的浸潤數量。MPO活性單位（×103U）/kg=（ΔA460/min）÷（11.3×所加組織量/L反應液）。

1.5 統計學處理：實驗結果均以均數±標準差表示，采用SPSS10.0統計軟件t檢驗對實驗數據進行統計分析。

2結果

2.1組織中CD18mRNA的表達：凝膠電泳結果顯示實驗組與對照組各時間點均有陽性條帶，PCR產物從凝膠上回收擴增后，序列測定顯示為整合素CD18的cDNA。利用Labworks軟件對各陽性條帶進行分析，結果顯示：兩組各陽性條帶的灰度值存在差異，而內參照β-Actin的表達兩組間沒有差異(圖1)，兩組CD18 mRNA的表達均隨時間推移而逐漸升高，至12h達峰值，此后略有下降，撕脫2h后實驗組各時間點CD18 mRNA的表達明顯高于對照組（圖2） (P<0.05)。

2.2組織中MPO活性的變化 實驗組MPO活性于傷后逐漸升高，12h達峰值，對照組術后逐漸升高，6h達峰值，受傷2h后實驗組各時間點MPO活性數值明顯高于對照組（P<0.01）。（表1）

3討論

皮膚撕脫傷是整形外科常見創傷，臨床救治中我們常會見到受傷的組織早期血運良好，但原位縫回后，隨著時間的延長，會逐漸出現部分組織的壞死，即組織的繼發性壞死。由于引發壞死的機制尚不甚清楚，目前缺乏有效的應對措施，也直接影響了皮膚撕脫傷的臨床救治效果，因而探索、研究組織繼發性壞死的機制，對于預防組織壞死、提高皮膚撕脫傷臨床救治效果有著重要的意義。為此我們已進行了大量的相關研究，并取得了一定的進展，發現撕脫組織中自由基增加、鈣離子超負荷、TXA2/PGI2、選擇素等的變化在組織繼發性壞死中扮演著重要角色[4-5]。

隨著研究的不斷深入，我們發現，撕脫組織在受傷的瞬間，來自基底及周圍的血液供應被即時阻斷，血供來源僅依靠與本體相連的蒂部。由于血供方式的突然改變，大部分撕脫組織處于缺血狀態。隨著傷后時間的推移，組織血循環得以重新分布，處于缺血狀態的受傷組織再次得到血流灌注。但組織學研究發現，隨著時間的延長，受傷組織中出現大量的炎細胞浸潤，并有大量微血栓形成，最終導致了部分組織的壞死。這些繼發性組織病理改變是否與早期撕脫組織的再灌注損傷有關是值得我們進一步關注的問題。已有的研究顯示，粘附分子在皮瓣的缺血再灌注損傷中發揮著重要作用[1]，其中整合素CD18所介導的中性粒細胞損傷在其中扮演著重要角色，它與皮膚撕脫傷組織繼發性壞死的關系是本研究所關注的重點。

中性粒細胞含有MPO，每個細胞所含酶的量是一定的，約占細胞干重的5%，該酶具有還原過氧化氫的能力，利用此特點，通過分析組織中MPO的活力，就可以反應組織中中性粒細胞的數量變化[6]。我們的研究也利用了中性粒細胞的這一特點，對受傷組織中中性粒細胞數量隨時間的變化進行了檢測。結果顯示，撕脫傷后隨著時間的延長，MPO活性明顯增高，提示受傷組織中有大量的中性粒細胞聚集，這與組織學研究的結果完全一致[3]。MPO動態變化顯示，受傷組織中中性粒細胞的趨化在傷后12h達到了高峰，24h后仍無明顯下降趨勢。已有研究表明：中性粒細胞在組織和臟器的大量聚集和過度活化會對宿主產生破壞作用，釋放大量毒性氧自由基和蛋白水解酶，導致血管通透性增加、組織水腫等一系列病理變化[7-9]；同時被激活的中性粒細胞粘附于血管內皮，引起毛細血管前括約肌和后微靜脈損傷，流通受阻的中性粒細胞發生堆積，阻塞毛細血管，加重缺血損傷，最終導致局部組織的壞死。根據MPO的檢測結果，我們推測，皮膚撕脫傷早期，中性粒細胞向受傷組織的大量聚集可能是引發組織繼發性壞死的重要原因之一。

有關組織再灌注損傷的進一步研究顯示，中性粒細胞對組織的損害作用呈粘附依賴性，即依賴于中性粒細胞與內皮細胞之間的粘附，而這種粘附作用主要是通過中性粒細胞表面粘附蛋白CD18介導完成。通常情況下，中性粒細胞與內皮細胞間親和力較弱，相互間很少發生粘附，即使粘附也會很快分開，可能是與正常情況下粘附分子表達較弱有關。特定條件下，如缺氧、創傷等因素的刺激，粘附分子的表達可能會增強，甚至過度表達[10]，這種高表達為粒細胞與內皮細胞間的粘附提供了有力的支持。我們針對皮膚撕脫傷撕脫組織CD18的檢測顯示，撕脫傷后，受傷組織中CD18mRNA表達明顯增強，其表達隨著時間的延長與中性粒細胞的趨化呈正相關，提示這種高表達與組織中中性粒細胞的趨化、粘附密切相關。在此過程中由于中性粒細胞和內皮細胞的粘附所導致的粒細胞活化和內皮細胞的損傷引發了一系列的病理生理改變，包括毛細血管通透性增大、組織水腫及大量微血栓形成等，最終導致組織的壞死[11-12]。

本研究結果提示：整合素CD18在皮膚撕脫傷早期呈高表達，這種高表達CD18可能在組織繼發性壞死中發揮著重要作用。在創傷早期，特別是傷后12h內，有針對性地進行CD18的拮抗治療，將有效抑制中性粒細胞過度趨化、粘附所造成的組織壞死，對皮膚撕脫傷組織繼發性壞死起到積極的預防作用。

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[收稿日期]2007-05-14 [修回日期]2007-08-11

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”