ＲＧＤ高分子材料用于周圍神經(jīng)修復(fù)的生物學(xué)評價

摘 要：采用自行設(shè)計研制的新型可降解仿生RGD高分子材料用于周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)治療，研究其促進神經(jīng)修復(fù)的作用。為了了解復(fù)合材料的特性，本試驗從體外和體內(nèi)試驗多方面進行了評價。研究結(jié)果顯示，RGD高分子材料導(dǎo)管具有良好的生物相容性，是一種理想的周圍神經(jīng)修復(fù)材料。

關(guān)鍵詞：RGD高分子材料；周圍神經(jīng)；修復(fù)；生物學(xué)評價

中圖分類號：R745 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-015-04

新型生物材料近年來迅猛發(fā)展，材料的組成、形態(tài)、植入部位及用途日趨復(fù)雜，隨著組織工程研究的日益深入，人工合成的高分子材料及各種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的生長因子復(fù)合材料進行神經(jīng)缺損的修復(fù)越來越受到重視^[1-4]，隨之對材料的評價相應(yīng)也提出了更高的要求。對生物材料進行有效性和安全性評價是生物材料進入臨床前的關(guān)鍵環(huán)節(jié)^[5]。本實驗從體內(nèi)和體外實驗對自行設(shè)計的仿生材料RGD高分子材料進行了生物學(xué)評價。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合材料的制備

以神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)與組成的分析研究為基礎(chǔ)，設(shè)計并制備了RGD高分子復(fù)合材料〔RGD多肽接枝聚(羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸)/PDLLA/β-TCP〕，尺寸為 12mm×6mm×0.3 mm的薄膜，動物實驗前將膜縫制成直徑為1.5mm長12mm的導(dǎo)管。

1.2 體內(nèi)評價實驗

選擇體重約250g 的SPF級Wistar (由武漢疾病控制中心實驗動物所提供)，分離單側(cè)坐骨神經(jīng)，切斷，造成10 mm缺損，將RGD導(dǎo)管對動物模型離段神經(jīng)進行橋接。分別于3個月、6個月取材，進行組織學(xué)觀察。三頭肌濕重比，電生理測定，電鏡及光鏡下的觀察。

1.3 體外評價實驗

(1)材料的體外降解實驗：將材料置于模擬體液中，測定其介質(zhì)PH值的變化和測定材料質(zhì)量損耗率。(2)細胞活力的測定：將分離純化的外周神經(jīng)膠質(zhì)細胞即雪旺細胞置于材料培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，然后采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法進行細胞活力的測定。可以反映活細胞數(shù)量和細胞代謝活性，從而間接反映生物材料的細胞毒性。(3)形態(tài)學(xué)觀察：在相差倒置顯微鏡下觀察細胞在生物材料表面或在其浸提液中的生長狀況，進行細胞粘附、增殖和分化，細胞數(shù)目，細胞突起長度等多種指標(biāo)。將RSC96細胞制成密度為106大小的細胞懸液，接種到24孔板中的復(fù)合膜上，每孔1ml，置于培養(yǎng)箱中，隔天換液，培養(yǎng)5天后取出，用戊二醛固定后，掃描電鏡觀察材料上細胞的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)評價結(jié)果

2.1.1 電生理檢測

術(shù)后所有大鼠術(shù)側(cè)即右側(cè)小腿三頭肌萎縮，6個月較3個月有所恢復(fù) (見表1)。血管的再生和重建，反映了生物材料與宿主組織間良好的相容性。檢測右側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(見表2)，結(jié)果顯示，再生神經(jīng)已經(jīng)生長通過缺損段，運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNVC)反應(yīng)了神經(jīng)干的傳導(dǎo)功能，再生軸突髓鞘化和成熟程度的指標(biāo)。6個月時RGD高分子材料神經(jīng)傳導(dǎo)速度達64.24±0.79m/s，與自體神經(jīng)移植接近(P>0.05)。

2.1.2 亞甲藍多色液染色

3個月后，再生神經(jīng)亞甲藍染色圖片顯示神經(jīng)纖維密度大，有髓神經(jīng)多，髓鞘大，多呈圓形圖。移植6個月神經(jīng)纖維直徑較3個月顯著增大，髓鞘厚度也有所增加，神經(jīng)纖維密度大，但較自體神經(jīng)組密度稍小，軸突直徑和厚度與自體神經(jīng)移植相當(dāng)。

2.1.3 HE染色

HE染色片光鏡下觀察，3個月后RGD高分子材料組再生神經(jīng)外膜完整，再生神經(jīng)截面呈橢圓形，可清晰分辨出神經(jīng)外膜，神經(jīng)束膜和材料區(qū)，神經(jīng)纖維數(shù)目多，大小均勻，成熟良好，在材料區(qū)可見RGD復(fù)合材料已成碎片狀，內(nèi)有細胞長入，材料外層有纖維組織包裹。6個月后，材料降解較3個月時多，碎片有所減少，材料區(qū)內(nèi)有細胞長入，外層有纖維組織包裹。

2.1.4 透射電鏡觀察結(jié)果

移植3個月后，雪旺細胞較多，雪旺細胞功能活躍，細胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，神經(jīng)絲和微管，游離核蛋白體發(fā)達，細胞外層基板連續(xù)，結(jié)構(gòu)完好，軸突內(nèi)線粒體多，結(jié)構(gòu)完好，軸突內(nèi)神經(jīng)絲略松散；髓鞘板層結(jié)構(gòu)致密。6個月后，再生神經(jīng)纖維數(shù)目較多，與自體神經(jīng)移植數(shù)目相當(dāng)。與3個月相比，再生神經(jīng)纖維的軸突面積明顯增大。

2.1.5 免疫組化染色分析

S-100免疫組化染色片顯示移植3個月后，S-100陰性片子由于無S-100蛋白表達，背底呈淡藍色，無陽性反應(yīng)，6個月后陽性部位較少。

2.1.6 材料的掃描電鏡觀察

體內(nèi)植入3個月后，復(fù)合膜中RGD高分子材料部分降解，形成孔隙，6個月后，孔隙進一步變大并連通(圖1、2)

圖1 3個月 電鏡掃描

圖2 6個月 電鏡掃描

2.2 體外評價結(jié)果

2.2.1 膜質(zhì)量損耗率的變化及介質(zhì)PH值的變化

RGD高分子材料降解速度較快，在第4周時膜損耗率超過30%，第12周時超過50%，第24周時膜損耗率已達到70%。pH值下降較快，24周內(nèi)的降解pH值基本呈下降趨勢，第2周左右達6.8，呈微酸性(圖3)。

圖3 RGD復(fù)合材料體外降解3個月分子量的變化

2.2.2 細胞活力的測定

雪旺細胞在RGD高分子材料上能夠較好地增殖，與空白對照組相差不大，尤其是在培養(yǎng)7天以后，其增殖能力良好。

2.2.3 形態(tài)學(xué)觀察

在相差倒置顯微鏡下觀察RSC96細胞在RGD高分子材料上的生長圖片，細胞生長狀況良好，密度較大，RGD為多孔材料，孔隙直徑在3.8um~7.6um之間，部分細胞向膜的孔隙中生長，細胞突起于膜片表面及孔隙中交織；細胞平鋪于材料表面生長，由于RGD高分子材料降解速率快，膜表面孔徑較大，直徑在1.5~30um之間，部分細胞向膜孔隙中生長( 圖4，5)。

圖4 掃描電鏡觀察RSC96細胞 RGD×2000

圖5 在材料上的生長情況 RGD×3000

3 討論

神經(jīng)修復(fù)材料的基本要素：理想的神經(jīng)修復(fù)用支架材料應(yīng)具備以下幾個特點：①良好的生物相容性，無毒性反應(yīng)；②可降解性，避免二次手術(shù)取出；材料降解速率與組織再生完成的時間匹配；③通透性，材料應(yīng)具有微孔或網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)以保證一定的通透性，使氧氣、小分子營養(yǎng)物質(zhì)等可進入到再生神經(jīng)短段微環(huán)境中；④合適的可塑性和力學(xué)性能；能在一定時限內(nèi)保持其外形和結(jié)構(gòu)的完整性^[6]。目前，用于神經(jīng)修復(fù)的支架材料主要是一些可降解的天然基質(zhì)材料和人工合成材料。生物活性分子RGD 肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸) 作為天然ECM 重要組成，是目前應(yīng)用最廣、最有效的促黏附肽^[7]。

RGD高分子材料的制備及原理：運用仿生學(xué)原理模擬細胞外基質(zhì)蛋白與其周圍細胞的相互作用，用物理或化學(xué)的方法在材料上接上粘附性蛋白或多肽以賦予材料生物信號，促進細胞粘附到材料上。本實驗將L-賴氨酸與α-羥基酸(羥基乙酸，乳酸)共聚制備聚(乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸)，然后通過L-賴氨酸的側(cè)氨基引入短肽RGD高分子材料，得到RGD高分子材料多肽接枝聚(乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸)，再將RGD高分子材料多肽接枝聚與PLA復(fù)合，所得的RGD高分子材料高分子復(fù)合材料兼具天然基質(zhì)材料和人工合成材料兩者的優(yōu)點。乳酸和羥基乙酸的共聚物(PLGA)，屬于α- 羥基酸衍生的脂肪族聚脂，降解性能和力學(xué)性能較好；具有很好的生物相融性，在生物體內(nèi)的最終降解產(chǎn)物為水和CO2無毒的生物小分子而被人體直接吸收^[8]，被美國FDA 認證為可應(yīng)用于人體的可降解材料、藥物釋放控制體系和其它人體植入的裝置^[7，9]。天然基質(zhì)材料精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 ((Arg-Gly- Asp，RGD)，因其含有特定的氨基酸序列而具有細胞識別信號，有利于細胞粘附；另一方面，PLA的降解產(chǎn)物顯酸性，易導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，而β-磷酸三鈣(β-TCP)在體內(nèi)水解呈弱堿性，與人體骨骼組織的無機成份相似，具有良好的生物相容性，易被生物降解吸收，無毒副作用，加入β-TCP可緩解PLA降解造成的局部酸性環(huán)境。

有研究顯示神經(jīng)導(dǎo)管移植排斥反應(yīng)的最明顯表現(xiàn)就是在神經(jīng)移植物的局部有大量的單核細胞浸潤膜內(nèi)外，神經(jīng)外膜消失，神經(jīng)內(nèi)血管減少，雪旺細胞大量喪失并被單核細胞替代^[10]。本實驗顯示PRGD高分子材料導(dǎo)管能有效誘導(dǎo)缺損段神經(jīng)與遠端貫通，所有的神經(jīng)導(dǎo)管局部未見上述反應(yīng)，說明該材料具有良好的組織相容性。導(dǎo)管內(nèi)再生神經(jīng)生長良好，與自體神經(jīng)相當(dāng)證實其良好的修復(fù)效果。材料降解速率快，第12周時超過50%，24周時超過70%，無需二次手術(shù)取出，同時使用方法簡單，對于顯微外科技術(shù)要求較低，易于被臨床接受。體外培養(yǎng)結(jié)果表明這種套管能使雪旺細胞黏附于其上生長，我們將進一步通過在套管內(nèi)添加活性細胞如雪旺細胞和活性神經(jīng)營養(yǎng)因子來改善神經(jīng)修復(fù)效果，以尋求一種更好的組織工程化的人工神經(jīng)，使周圍神經(jīng)再生的效果最大、最優(yōu)化。

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(責(zé)任編輯：王尚勇)

Biocompatibility Estimation of RGD Macromolecule Biomaterials for Restoring Peripheral Nerve

Wang Yonghong，Yi Yixia，Yan Qiongjiao，LI Shipu

Abstract：To develop a novel type peripheral nerve repairing material and observe the characteristics of the composite material. The new RGD macromolecule biomaterial was synthesized and the characteristics of the composite materials were evaluated in vitro and in vivo. The results showed that the RGD macromolecule biomaterial possesses good biocompatibility and is one kind of ideal materials for peripheral nerve regeneration.

Key words：RGD macromolecule biomaterial；Peripheral nerve；Regeneration；Biocompatibility