合成冰片的短期遺傳毒性測試研究

摘 要：目的：觀察合成冰片的致突變性。方法：采用Ames試驗(yàn)、細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)。結(jié)果：合成冰片在0.4～250μg/皿范圍內(nèi)(+/-S9mix)，Ames試驗(yàn)結(jié)果陰性。24h的CHL細(xì)胞IC₅₀為85.74μg·ml^-1。80、40、20、10、5(μg·ml^-1)下，染色體畸變率均<5%。微核試驗(yàn)中各劑量組微核發(fā)生率與陰性對照組比較差異無顯著性，P>0.05。結(jié)論：合成冰片未顯示致突變性。

關(guān)鍵詞：合成冰片；致突變性；Ames試驗(yàn)；CA試驗(yàn)；MN試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R282；R114 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-2197(2008)04-044-03

冰片為常用芳香開竅中藥，按來源不同而有天然冰片、合成冰片之分，天然冰片多為龍腦香科植物龍腦香樹脂的加工品；合成冰片是以樟腦、松節(jié)油為主要原料經(jīng)化學(xué)方法合成。因龍腦香樹在我國沒有資源分布，價(jià)格昂貴，故目前大多使用合成冰片替代天然冰片^[1]。本文參照中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局頒發(fā)的《新藥(中藥)臨床前研究指導(dǎo)原則》的有關(guān)規(guī)定，采用鼠傷寒沙門氏菌誘變性試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))、細(xì)胞染色體畸變(CA)試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核(MN)試驗(yàn)檢測其致突變作用。

1 材料與方法

1.1 受試物

合成冰片由云南三木(集團(tuán))有限公司思茅香料廠提供，滇衛(wèi)藥準(zhǔn)字：(90)56-001，研細(xì)粉過140目篩，以二甲基亞砜(DMSO)或羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

采用TA97、TA98、TAl00和TAl02四株標(biāo)準(zhǔn)菌株(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng))。經(jīng)鑒定菌株遺傳特性均符合試驗(yàn)要求。

1.1.3 試驗(yàn)細(xì)胞株

中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所惠贈(zèng)，經(jīng)細(xì)胞株染色體核型鑒定合格。用pH7.2、含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液(GIBCO-BRL公司)，37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠(SPF級)，18～22g，雌雄各半。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK11-00-0008。

1.2 方法

1.2.1 Ames試驗(yàn)

培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)、肝臟微粒體酶混合液(S9mix)的組成均按Maron修訂方法進(jìn)行。采用平皿摻入法，合成冰片受試濃度設(shè)置為250、50、10、2和0.4(μg/皿)。同時(shí)設(shè)溶劑對照、空白(自發(fā)回變)對照、陽性誘變劑對照[敵克松(50.0μg/皿)作用于四種菌株(-S9)，活化試驗(yàn)中2-氨基芴(20.0μg/皿)作用于TA97、TA98、TAl00，1、8-二羥基蒽醌(50.0μg/皿)作用于TAl02]，按規(guī)定重復(fù)試驗(yàn)。用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算回復(fù)突變菌落數(shù)平均值(χ±s)。如在某一個(gè)測試濃度誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)為自發(fā)回變的2倍或2倍以上，判為陽性反應(yīng)^[2]。

1.2.2 染色體畸變試驗(yàn)

根據(jù)細(xì)胞毒性測定結(jié)果，合成冰片在2～125(μg·ml^-1)間IC₅₀為85.74μg·ml^-1(y=0.04271+0.00216x，r=0.9523)。故設(shè)80、40、20、10、5(μg·ml^-1)5個(gè)劑量，陰性對照為DMSO，陽性MMC 0.25μg·ml^-1(-S9)、CP 20μg·ml^-1(+S9)，及空白對照組(+/-S9)。每組3個(gè)平行樣。為避免S9mix處理時(shí)間過長對細(xì)胞的影響，選擇24h收獲細(xì)胞，收獲前6～10h加入秋水仙堿(終濃度0.2μg·ml^-1)，制備染色體標(biāo)本。每個(gè)標(biāo)本觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)染色體畸變率，記錄畸變類型：數(shù)目異常(P)、缺失(D)、碎片和粉碎化(F)、單體斷裂(B)、環(huán)狀染色體(R)、染色單體易位(T)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞畸變率<5%為(-)，>10%為(+)^[3，4]。

1.2.3 微核試驗(yàn)

合成冰片用1%CMC—Na水溶液稀釋至0.2g生藥/ml；以4.881、3.661、2.746、2.060、1.544和1.158(g/kg)ig小鼠；ICR小鼠按體重隨機(jī)分組，共設(shè)6組，每組10只(雌雄各半)。并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定劑距。使用《NDST新藥統(tǒng)計(jì)程序》軟件用Bliss法計(jì)算LD50及95%可信限^[5]。

據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇給藥24h作為制備骨髓標(biāo)本時(shí)相點(diǎn)。以LD₅₀的1/2、1/4、1/8設(shè)置劑量。陰性對照(等體積1% CMC-Na)；陽性對照(0.06g/kg·bw腹腔注射環(huán)磷酰胺)。采用一次染毒方法^[4]，制備骨髓涂片后每個(gè)動(dòng)物標(biāo)本隨機(jī)鏡檢1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)算微核發(fā)生率。同時(shí)注意區(qū)分成熟紅細(xì)胞(NCE)與PCE^[5]，如圖：

圖1 小鼠骨髓涂片(40×)

圖2 嗜多染紅細(xì)胞中的微核(100×)

圖1所示：a為NCE、b為PCE。圖2所示：箭頭所示為PCE中的微核。以正常小鼠微核率最大值均小于4‰作為判斷結(jié)果的參考值。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗(yàn)

如表1所示，合成冰片5個(gè)劑量組(+/-S9mix)均為陰性。

2.2 CA試驗(yàn)

合成冰片劑量組染色體分散良好，畸變?nèi)旧w少見(圖3)。

圖3 合成冰片(80μg·ml^-1)作用后的CHL細(xì)胞(100×)

而MMC和CP對照組畸變?nèi)旧w多見(圖4、5)。

圖4 MMC(0.25μg·ml^-1)作用后的CHL細(xì)胞(100×)

圖5 CP(20μg·ml^-1)作用后的CHL細(xì)胞(100×)

表2顯示除陽性對照組外，其他各組的染色體畸變率均<5%(+/-S9mix)。表明合成冰片對CHL細(xì)胞染色體無損傷作用。

2.3 微核試驗(yàn)

小鼠灌胃合成冰片LD₅₀值為2.983(2.538~3.507)g/kg。各劑量組PCE/NCE在正常值范圍。由表3顯示，各劑量組微核發(fā)生頻率雌鼠與雄鼠比較差異無顯著性，P>0.05；合成冰片微核率與陰性對照組比較差異無顯著性，P>0.05。提示微核試驗(yàn)結(jié)果陰性。

3 討論

近年中藥安全性問題越來越受到重視，而有關(guān)中藥的短期遺傳毒性測試研究報(bào)道日漸增多。冰片是復(fù)方丹參滴丸、速效救心丸等年銷售額過億的中成藥大品種的主要成份，在臨床和制藥行業(yè)頗受關(guān)注，對其安全性進(jìn)行深入研究有較重要意義。因此本研究選用了Ames試驗(yàn)、CA試驗(yàn)、MN試驗(yàn)這三個(gè)測試系統(tǒng)來檢測合成冰片的誘變性，這也是目前中國和歐共體制定的遺傳毒性評價(jià)方案中的標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)^[6]。本試驗(yàn)組合的三個(gè)測試系統(tǒng)結(jié)果均一致，提示合成冰片無致突變性，對遺傳物質(zhì)無損傷作用。為合成冰片的應(yīng)用提供遺傳毒理安全性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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(責(zé)任編輯：陳涌濤)

Study on The Mutagenicity of Synthetic Borneol

LIU Yang，JIANG Min，ZHANG Han，QU Cai-qin，LI Yi-lan，HU Li-min

Abstract：Objective：To evaluate the mutagenicity of Synthetic Borneol.Methods：The Ames test，the CA test and MN test were used.Results：Ames test at 5 doses(0.4~250g/plate) was negative.The IC₅₀ was 85.74μg·ml^-1(24h，r>0.9).The proportion of chromosomal aberration was less than 5% at 80、40、20、10、5(μg·ml^-1)(+/-S9mix).In MN test no significant difference were observed at the dose of 0.373、0.746、1.492(g/kg·bw)in micronuclei rates between the controlled and all groups(P>0.05).Conclusion：Synthetic Borneol have no mutagenic action though our study.

Key words：Synthetic Borneol；Mutagenicity；Ames Test；CA Test；MN Test