基因沉默技術(shù)的研究動態(tài)及在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

摘要：從RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、篩選及基因沉默的發(fā)生開始，概述了細(xì)胞水平基因沉默的效應(yīng)，并由細(xì)胞水平上過渡到模型動物試驗階段，在此基礎(chǔ)上，著手家畜基因沉默的研究，最后，涉及到基因沉默技術(shù)在畜牧業(yè)上的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：基因；沉默；RNA干擾；畜牧

中圖分類號：Q75；Q342

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-273x(2008)06-0016-02

基因沉默是雙鏈核糖核酸(RNA)介導(dǎo)的特異性轉(zhuǎn)錄后的基因失活現(xiàn)象，其本質(zhì)是RNA干擾(RNA interference，RNAi)，它是當(dāng)前生命科學(xué)中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。2001年和2002年RNAi研究連續(xù)兩年入選美國《科學(xué)》雜志評定的年度自然科學(xué)十大突破。目前，RNA干擾技術(shù)已成為基因功能研究的有力工具，并在人類疾病模型、基因治療、新藥研發(fā)以及畜牧遺傳育種等諸多領(lǐng)域展示了誘人的應(yīng)用前景。

RNAi技術(shù)在相對低等的真核生物中，比如錐蟲、線蟲和果蠅等，應(yīng)用最為廣泛深入，尤其在線蟲，已經(jīng)實現(xiàn)了全基因組水平的大規(guī)模、高通量的基因沉默研究，成為線蟲遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究工具和應(yīng)用平臺。比較而言，RNAi在哺乳動物上的進(jìn)展則曲折得多。早期研究發(fā)現(xiàn)，向哺乳動物體內(nèi)導(dǎo)人dsRNA，引發(fā)強(qiáng)烈的干擾素反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)信使RNA(mR-NA)的非特異性降解，全面抑制所有蛋白的合成。這從根本上限制了RNAi在哺乳動物中的應(yīng)用。幸運(yùn)的是，新研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入的雙鏈小RNA(dsRNA)小于30堿基(bp)時，既能特異性沉默內(nèi)源基因，又可逃避干擾素反應(yīng)通路，而當(dāng)引入dsRNA長度為21bp時，基因沉默效應(yīng)最為有效。這使得RNAi的研究進(jìn)入了哺乳動物時代。

1、細(xì)胞水平上的基因沉默

哺乳動物中最初的RNAi研究是在細(xì)胞水平進(jìn)行的。即針對靶基因，設(shè)計并體外合成21bp的雙鏈小干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細(xì)胞，然后觀察細(xì)胞代謝及表型的異常，從而確定靶基因的功能。此方法有兩大弊端，一是dsRNA的合成費(fèi)用非常昂貴；二是由于哺乳動物缺乏siRNA的內(nèi)源擴(kuò)增機(jī)制，因此基因沉默效應(yīng)是暫時性的，一旦導(dǎo)入的dsRNA耗盡，基因沉默效應(yīng)也就隨之消失。2002年Brummel Kamp等模擬和借鑒RNAi的機(jī)制，發(fā)明了一種siRNA表達(dá)載體。該發(fā)現(xiàn)一方面規(guī)避了昂貴的dsRNA合成，使RNAi實驗變得更加經(jīng)濟(jì)，實現(xiàn)了siRNA的持續(xù)表達(dá)，極大的拓寬了RNAi的應(yīng)用范圍。同年，Hasuwa等以及McCaffrev等應(yīng)用siRNA干擾載體，成功獲得了RNAi小鼠，在動物個體水平上實現(xiàn)了基因沉默，證明了RNA干擾技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因動物研究的可行性。這一進(jìn)展具有重大意義。一方面，它標(biāo)志著一種新的轉(zhuǎn)基因動物制備方法的誕生；另一方面，與傳統(tǒng)基因敲除小鼠的制備相比，應(yīng)用RNAi制備轉(zhuǎn)基因動物則無論經(jīng)濟(jì)還是技術(shù)上都有很大的優(yōu)勢。尤其RNAi動物表現(xiàn)的基因沉默效應(yīng)在表型上與相應(yīng)基因敲除動物具有一致性。最近，siRNA干擾載體的設(shè)計又有了新的進(jìn)展，Kasim等人將loxP序列插入siRNA載體的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)，利用Cre-loxP重組系統(tǒng)實現(xiàn)了siRNA的誘導(dǎo)性表達(dá)，另外的一些學(xué)者將能夠被強(qiáng)力霉素或蛻皮素激活的特殊轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅲ啟動子整和在一起，構(gòu)建了可誘導(dǎo)的siRNA表達(dá)載體，使人們能夠按意愿控制siRNA的表達(dá)與否，將基于載體的RNAi提高到了一個新的水平，也使得條件型基因沉默小鼠的構(gòu)建成為可能。

2、小動物上的基因沉默

基因沉默小鼠的成功制備，證明RNAi技術(shù)能夠在動物個體水平上實現(xiàn)基因沉默。就研究基因功能而言，基因沉默小鼠在很大程度上可以取代傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)，而就技術(shù)路線和遺傳效應(yīng)而言，基因沉默小鼠還具有傳統(tǒng)基因敲除所無法具備的獨(dú)特優(yōu)勢。第一，從技術(shù)角度考慮，制備基因敲除個體涉及打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞培養(yǎng)、同源重組、生殖系嵌合體制備等多項高難度的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)；而基因沉默小鼠利用新興的RNAi技術(shù)制造特定基因的失活，技術(shù)新、步驟少、實驗周期短、技術(shù)難度小、成本低。第二，從遺傳學(xué)角度考慮，傳統(tǒng)基因敲除一般只能失活個體兩個等位基因中的一個，相當(dāng)于隱性突變，往往需進(jìn)一步繁育生成突變純合鼠才能觀察到表型效應(yīng)：而基因沉默通過靶mRNA的抑制和降解制造功能缺失，相當(dāng)于顯性突變，因此可以省略傳代純合步驟，直接在雜合子中觀察靶基因功能缺失的表型效應(yīng)，從而顯著加快實驗進(jìn)程。因此，基因沉默技術(shù)有望成為適應(yīng)后基因組時代需求的、新型的、經(jīng)濟(jì)快捷的哺乳動物個體水平基因功能研究平臺，基因沉默小鼠制備技術(shù)的研究和提高意義重大。

基因沉默小鼠技術(shù)體系主要包括基因沉默載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因動物制備及基因沉默效應(yīng)的評估3個主要技術(shù)環(huán)節(jié)，其中以siRNA干擾載體的設(shè)計和構(gòu)建最為關(guān)鍵。目前應(yīng)用最廣泛的干擾載體是基于莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的干擾載體，早期研究認(rèn)為莖部長度為21bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)源的siRNA結(jié)構(gòu)最為相近，基因沉默效應(yīng)也最高，最近卻有研究發(fā)現(xiàn)，莖部長度為27bp或29bp時，引發(fā)的基因沉默效應(yīng)可能顯著增加，甚至百倍于傳統(tǒng)的21bp莖環(huán)結(jié)構(gòu)。小鼠基因沉默技術(shù)目前存在的主要問題有兩個：第一，人們目前對21bp、27bp及29bp發(fā)夾沉默效應(yīng)相對優(yōu)劣的理解都只是基于細(xì)胞水平的研究，缺乏動物個體水平的驗證；第二，人們對siRNA干擾載體在基因沉默小鼠中的整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)，以及在不同組織中的表達(dá)情況和沉默效應(yīng)，以及可能產(chǎn)生的副效應(yīng)的認(rèn)識幾乎空白，缺乏基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)和資料。通過建立小鼠基因沉默技術(shù)體系，為小鼠個體水平的RNAi研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)和資料，為家畜個體水平的基因功能研究提供有力的技術(shù)平臺，也將為基因沉默技術(shù)在豬育種中的未來應(yīng)用打下基礎(chǔ)，同時添補(bǔ)基因沉默數(shù)據(jù)和資料的空白。

3、家畜上的基因沉默

基因沉默技術(shù)還可作為一項新技術(shù)應(yīng)用于畜牧業(yè)的遺傳育種領(lǐng)域，尤其是豬的育種。第一，豬育種研究中，應(yīng)用RNA干擾的基因沉默技術(shù)可以促進(jìn)生長，提高肉質(zhì)。已有的研究表明，豬的生長發(fā)育過程是一系列正調(diào)控基因和負(fù)調(diào)控基因共同作用的結(jié)果，這一普遍規(guī)律同樣適用于與育種密切相關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)性狀。如生長速度受生長激素基因的正調(diào)節(jié)和生長抑制素基因的負(fù)調(diào)節(jié)，肌肉的發(fā)育與組成受胰島素樣生長因子正調(diào)節(jié)和肌細(xì)胞生長抑制素基因的負(fù)調(diào)節(jié)，脂肪組織的發(fā)育亦然。因此，育種實踐中可以根據(jù)育種的需要，利用基因沉默技術(shù)，一方面抑制牛長和肌肉的負(fù)調(diào)控，另一方面加強(qiáng)脂肪組織發(fā)育的負(fù)調(diào)控，從而達(dá)到促進(jìn)生長，提高瘦肉率的目的。不僅如此，哺乳動物功能基因組的進(jìn)展和中同一丹麥家豬基因組計劃的順利實施，必將大大深化對家豬生長機(jī)理的認(rèn)識，并探明肌肉一脂肪組織調(diào)控的精細(xì)機(jī)制，這將在不影響肌間脂肪組織發(fā)育的前提下，利用基因沉默技術(shù)特異性抑制背部脂肪的沉積(背膘厚)，從而達(dá)到提高肉質(zhì)的目的。第二，豬育種研究中，基于RNA干擾的基因沉默技術(shù)可用于抗病育種，即針對危害大、傳播力強(qiáng)的豬病毒性傳染病，如豬瘟、豬繁殖呼吸綜合征等，利用基因沉默技術(shù)設(shè)計特異性的沉默載體來抑制病毒關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄，干擾病毒的復(fù)制和組裝，從而達(dá)到抗病目的。第三，就育種的路線來說，基于RNA干擾的基因沉默技術(shù)就有可能成為未來轉(zhuǎn)基因豬育種的關(guān)鍵過渡環(huán)節(jié)。在國家的重視下，我國的轉(zhuǎn)基因豬研究已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，積累了雄厚的技術(shù)儲備。我國早在20世紀(jì)80年代末就建立了成熟的豬顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)，最近又成功構(gòu)建了體細(xì)胞克隆豬，從而能采用體細(xì)胞打靶～核移植路線進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種。然而，目前的豬轉(zhuǎn)基因育種仍有兩個難題，一是現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不完善，二是難于選擇合適的育種靶基因。家豬基因組計劃的順利實施，進(jìn)一步深化對家豬基因功能以及基因間相互作用的理解，并在不久的將來提供大量候選基因作為轉(zhuǎn)基因育種的靶基因，因此預(yù)計靶基因選擇的困難是暫時性的。目前最重要的是大力解決技術(shù)上的困難，即轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不完善問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不完善突出表現(xiàn)在兩個方面：一是已有的轉(zhuǎn)基因豬育種實踐證明，外源促生長基因的過表達(dá)往往會干擾豬正常的生長發(fā)育過程，因此基于內(nèi)源基因的測控要優(yōu)于基于外源基兇的調(diào)控，小鼠基因沉默技術(shù)正好提供了內(nèi)源基因調(diào)控的理想技術(shù)平臺。然而目前的小鼠基因沉默技術(shù)還主要依賴于原核注射法，缺陷在于轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)串聯(lián)整合容易產(chǎn)生副效應(yīng)，不利于穩(wěn)定育種。體細(xì)胞打靶—核移植路線，雖然解決了轉(zhuǎn)基因的定點(diǎn)和單拷貝整合問題，但體細(xì)胞打靶—克隆的難度和低效性卻是一個瓶頸。鑒于基因沉默的綜合效應(yīng)只能在動物水平進(jìn)行評價，因此，基岡沉默育種的成功突破可能需要篩選和嘗試數(shù)個備選基因，這個過程不適合采用體細(xì)胞打靶—核移植路線。理想的方案是在豬轉(zhuǎn)基因育種研究中將RNA干擾技術(shù)、原核注射法和體細(xì)胞打靶—核移植路線有機(jī)結(jié)合起來，即首先利用原核注射路線制備基因沉默的轉(zhuǎn)基因豬。進(jìn)行育種靶基因的初步篩選，對勝出的靶基因則采用體細(xì)胞打靶—核移植路線作為最終育種路線。

4、基因沉默(干擾)技術(shù)的應(yīng)用前景

RNAi領(lǐng)域之所以具有如此強(qiáng)大的生命力，有兩個關(guān)鍵：一是RNAi是真核生物普遍存在的保守的生命機(jī)制，執(zhí)行多種重要的生理功能；二是RNAi在基岡功能、疾病模型、遺傳育種等多個領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。目前，哺乳動物RNAi研究雖然取得了引人矚目的成就，但作為一種全新的領(lǐng)域和技術(shù)，預(yù)計還有巨大的上升空間。未來的哺乳動物RNAi研究將呈現(xiàn)以下四方面的趨勢：①在細(xì)胞水平，RNAi的基因功能研究將和基因芯片技術(shù)有機(jī)結(jié)合，向大規(guī)模、高通量的基因組水平發(fā)展。在這方面，國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大膽的嘗試。②在動物個體水平，以RNAi為基礎(chǔ)的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)將得到快速發(fā)展。③在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，RNAi介導(dǎo)的基因治療和新藥研發(fā)將逐步從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)移。④在畜牧領(lǐng)域，以RNAi為基礎(chǔ)的基因沉默技術(shù)作為一種家畜育種手段將發(fā)揮很大的作用。作為家畜的模式動物——小鼠的基岡沉默是所有工作的前期探索，國家自然科學(xué)基金資助項目“應(yīng)用RNA干擾技術(shù)制備EGFP基因沉默小鼠的研究”正是以綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因。以建立、提高以及完善動物個體基因沉默技術(shù)為目標(biāo)，重點(diǎn)是對不同沉默載體在動物個體水平的表現(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)的評估和優(yōu)化，為家畜的基因沉默奠定堅實的基礎(chǔ)，以促進(jìn)家畜沉默技術(shù)的盡快發(fā)展，推廣應(yīng)用于畜牧業(yè)現(xiàn)代化生產(chǎn)中。