基因治療：基因生物技術的重要里程碑

基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學技術。基因治療是當代醫學和生物學一個新的研究領域。它試圖從基因水平調控細胞中的缺陷基因表達或以正常基因矯正、替代缺陷基因，達到治療基因缺陷所致的遺傳病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的腫瘤等疾病，即與基因相關的疾病。

根據臨床統計，25%的生理缺陷、30%的兒童疾病和60%的成年人疾病都是由遺傳病引起的。而人類遺傳病大約有5000種，大部分是單基因缺陷造成的道機體是一個復雜的動態性的平衡系統。每一個基因對機體的正常功能的影響都是復雜的，任何一個基因的變化都會導致多種癥狀的發生。由于這些疾病病因復雜而且發生在遺傳物質水平，用傳統的治療方式很難達到根治目的，而且價格昂貴周期長。基于以上這些原因，人們一直致力于尋找新的、更好的、更徹底的遺傳疾病治療方法。隨著分子生物學和分子遺傳學等學科的飛速發展、人們對遺傳病的分子機理的深入了解以及許多遺傳疾病分子模型的建立，特別是人類基因組計劃超乎預想的發展和后基因組計劃、蛋白質組計劃的提出，使人們自己的遺傳背景和基因與疾病的關系有了更清楚的認識。這些都使人的基因治療成為可能。

基因治療是近十年來發展起來的新型醫療技術，有廣闊的研究、應用和開發前景，但是，它還需要解決許多基礎研究和技術方面的問題，才能具有真正的實用價值。總而言之，基因治療隨著分子生物學、分子遺傳學和臨床醫學等學科的發展，它將日益走向成熟。

白介素12基因治療腫瘤實驗研究

項目簡介：該研究以缺陷型Adv5腺病毒為載體構建、包裝了攜帶白介素12基因和重組腺病毒AdvCMVIL12。病毒滴度測定顯示該重組腺病毒具有很高的滴度；生物學活性測定表明，當病毒滴度為100MOI時，培養的rTMC細胞上清中白介素12的分泌量達到3417±736NG/1×10^6細胞/24h；體內實驗結果表明，局部注射AdvCMVIL12對多種不同的腫瘤有明顯的抗腫瘤效果，對四種腫瘤rTMC-RTC-R2、H22、XTC-1的抑制率分別為67%、66%、93%、6.4%。AdvCMVIL12能夠在瘤體內產生大量具有生物學活性的細胞因子白介素12，從而解決了單純注射白介素12達到治療劑量時所帶來的毒副作用。

所處階段：中期階段

納米載體介導基因治療研究

項目簡介：該項目進行了將納米技術、基因工程技術與干細胞工程技術結合起來，促進基因治療的研究。項目以丙烯酸甲酯和乙二胺為起始單體合成聚酰胺－胺樹枝狀聚合物（PAMAM Dendrimer），該聚合物納米載體可有效地將目的基因（綠色熒光蛋白基因pEGFP-C1）轉入造血干細胞、胚胎肝細胞、樹突狀細胞、Hela細胞、K562細胞等；分別構建了抗凋亡信號分子（Caspase-3）、抗MHC Ⅱ類抗原轉錄活化子（Class Ⅱ transactivator，CIITA）、抗慢性粒細胞性白血病BCR-ABL融合基因的核酶序列的真核表達載體。

項目成果將為各種血液及實體腫瘤的基因治療增添新的研究方法，有望解決骨髓移植和組織工程細胞來源的問題。

惡性腫瘤基因治療系列探討

項目簡介：該課題分四部分：血管抑素基因治療抑制腫瘤新生血管形成；反義缺氧誘導因子基因治療提高腫瘤免疫治療的療效，達到根除腫瘤的效果；聯合VHL和反義缺氧誘導因子基因從不同層面阻斷腫瘤缺氧誘導反應，根除腫瘤；聯合應用血管抑素和內皮抑素基因治療抑制了轉移腫瘤的生長延長了動物的生存期。研究中主要對基因治療的轉染效率，基因表達的水平，相關下游基因的表達，腫瘤生長曲線，腫瘤內血管的密度，腫瘤細胞凋亡，動物的生存率等進行了檢測。

項目為惡性腫瘤的基因治療提供了理論根據，研究中創立了新的基因治療方法，尤其是在聯合抗血管化治療和免疫治療，阻斷缺氧誘導反應治療，VHL基因治療和經肌肉基因治療等方面，理論上有創新，基因治療方法上有改進，有較大的社會和經濟效益。

所處階段：中期階段

血友病A基因治療臨床前研究

項目簡介：基因治療是治療遺傳性疾病的根本措施。該研究以血友病A（遺傳性凝血因子VⅢ缺陷癥）為契口，在FVⅢcDNA克隆和去B區（BDD）FVⅢcDNA改造獲得成功的基礎上，又致力于研究安全有效的表達載體、適宜的基因特異靶細胞以及血友病A動物模型等研究工作。

該研究首選復制缺陷性逆轉錄病毒、脂質體（DOTAP）和納米材料（聚酰胺－胺型樹枝狀聚合物，PAMAM）作為BDDFVⅢcDNA表達載體，無論在體內、外均獲得高效表達。

此外，項目課題組與美國賓夕法尼亞大學合作建立了腺相關病毒載體（AAV）制備技術平臺，并正在進行BDDFVⅢcDNA在rAAV中的表達研究；該課題組還正在與國內南方模式動物中心和澳大利亞Monach大學合作進行血友病A動物模型的制備，均已取得較好的進展，并繼續作深入合作研究。該項目同時對多種遺傳性凝血因子缺陷癥進行了分子發病機制的研究，為進一步作基因治療奠定了基礎。

反義基因治療慢性髓細胞白血病研究

項目簡介：該項成果運用反義基因技術，研究了AS PS-ODN、AS PS-ODN與CTX聯合以及HIV-AS PS-ODN等對CML細胞的生長、細胞凋亡及bcr/abl基因表達的影響。研究中開發了第三代新型病毒載體系統HIV-Vector，轉導率為99%，明顯高于病毒載體（38%）；AS PS-ODN+CTX新的聯合方案及HIV-AS PS-ODN新載體轉導AS PS-ODN，均大大提高其轉導率；對慢性髓細胞白血病細胞的誘導凋亡作用明顯增強，可能解決由于反義核酸用量過大、價格昂貴而難以臨床應用的難點。

所處階段：中期階段

實驗性肝纖維化反義基因治療研究

項目簡介：該課題應用重組DNA技術構建反義TIMP-1真核細胞表達質粒，并將其轉移至纖維化大鼠肝內和體外培養的大鼠肝臟星形細胞中，結果顯示構建的反義TIMP-1表達質粒可在肝星形細胞中及肝纖維化大鼠體內確切表達，導致肝星形細胞培養液間質膠原酶活性顯著增加，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達明顯下調；并促使治療組動物肝組織活化間質膠原酶及潛在膠原酶活性均有較明顯增加，羥脯氨酸含量下降。同時成功構建了反義TβRⅠ、TβRⅡ真核細胞表達質粒，經導入免疫性大鼠肝纖維化模型中，結果表明重組質粒在動物體內能確切表達，并在mRNA水平上封閉實驗性大鼠肝臟中TβRⅠ、TβRⅡ的基因和蛋白質表達。可顯著降低肝組織羥脯氨酸含量，明顯減少肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積，并促進肝臟病理一定程度的改善。

實驗性癲癇后腦損傷機制及基因治療

項目簡介：該課題經過5年研究成功地制作了與人類癲癇高度相近的大鼠杏仁核點燃癲癇動物模型，從病理形態學檢查明確了癲癇的腦損傷改變，并系統研究了神經遞質、神經營養因子、縫隙蛋白等實驗性癲癇中的變化，探討了突破重建在癲癇中的作用。證實神經遞質、神經調質及縫隙連接在癲癇發病中起重要作用，明確癲癇是多因素共同作用的結果。在癲癇治療方面針對CX43形成的特異性GJ陰斷劑－連接蛋白擬似肽和廣譜的GJ阻斷劑－甘珀酸，對腦電活動的抑制作用進行對比研究。以利于查明癲癇治療的新的靶點，為癲癇的有效防治提供一條新途徑和新思路。該研究從超微結構、形態學、分子生物學角度探討了癲癇后腦損傷改變及神經遞質、神經營養因子、縫隙連接、突觸重建等在癲癇發生發展中的重要作用，明確了癲癇腦損傷的多源性調節機制，并從基因水平對癲癇的治療進行了探討，發現了較為有效的治療進行了探討，發現了較為有效的治療途徑和方法，為今后的進一步研究奠定了基礎。

應用基因治療技術修復組織創傷實驗研究

項目簡介：該研究的目的在于利用重組復制缺陷型腺病毒載體介導，應用VEGF增加隨意皮瓣、軸型皮瓣、靜脈皮瓣遠端新生血管形成，防止缺血造成的皮瓣壞死。該研究利用制備的載體AdCMV-VEGF為復制缺陷性腺病毒，能感染真核細胞并表達VEGF，表達的VEGF具有增加血管能透性，促進血管增生的生物學活性。同時建立了生理性皮瓣、非生理性皮瓣缺血模型。進行了基因局部真皮下注射皮瓣預制，局部真皮下應用腺病毒載體具有安全、簡便、創傷小特點，遠位轉染少，外源基因主要在局部表達，對全身影響小。發現腺病毒為載體在體內表達時間短的特點。

融合CD-ES基因治療惡性腫瘤實驗研究

項目簡介：研究將兩個不同功能的基因（CD 、ES）作成融合基因，再導入穿梭質粒，最后通過細菌內重組法及在293細胞內包裝、擴增重組腺病毒 (rAdCDglyES)，使其具有直接殺傷瘤細胞，阻止瘤新生血管形成、間接殺傷瘤細胞和阻止瘤遠端轉移及放療增敏作用增強放療療效。

抑瘤多肽TSF及其基因治療載體組合物

項目簡介：該發明涉及一種新的重組腺病毒載體介導的抗腫瘤治療組合物，具有靶向性抗腫瘤組織內血管新生、抑制腫瘤包括造血系統惡性腫瘤生長及轉移作用，具體步驟是以特異引物經PT-PCR方法從正常人外周血細胞克隆出編碼TSF多肽的cDNA序列，以AdEasy System在人胚腎細胞293中構建、包裝表達TSF的重組腺病毒載體，大規模制備并純化該載體用于體內外活性測定。

腺病毒介導基因治療與放療聯合治療腫瘤研究

項目簡介：為提高腫瘤基因治療的療效，減少其副作用，研究其與常規的放療結合。首次將AdCMVIL-12基因療法與傳統放療聯合治療小鼠Lewis肺癌，發現聯合療法有互相促進作用。體外實驗首次證實電離輻射明顯提高了腺病毒對Lewis肺癌細胞的轉染率，從而提高了IL-12的表達。用放療與腺病毒介導的IL-12基因聯合應用，增加腺病毒轉染率，提高了抗腫瘤療效，降低了副作用。為腫瘤的基因治療提供新的線索，并將會帶來一定的社會效益和經濟效益。

HSV-TK和B7聯合基因治療乳腺癌實驗研究

項目簡介：該試驗將HSV—TK、B7基因經逆轉錄病毒介導，并轉導GCV對乳腺癌細胞進行體外細胞、體內荷瘤抗腫瘤作用觀察。理論依據為：逆轉錄病毒載體將外源目的基因整合到靶細胞染色體；HSV—TK被導入細胞后，其TK基因對GCV的敏感性提高并使之磷酸化，竟爭性地抑制細胞DNA的合成而殺死腫瘤細胞；HSV—TK/GCV系統具有“旁觀者效應”，擴大殺傷范圍；將B7基因引入腫瘤細胞后可刺激機體T淋巴細胞的免疫性，使腫瘤細胞具有高免疫原性。

該試驗主要創新點在于在國內外首次將TK/B7不同的目的基因聯合應用治療乳腺癌，觀察到治療上的協同性，取得了滿意的效果，在晚期乳腺癌的治療方面有良好的推廣應用前景。

門靜脈高壓癥時一氧化氮在發病中的作用及基因治療研究

項目簡介：肝內阻力增加是肝硬化門靜脈高壓癥（PHT）的始動因素，而由血管活性物質增多引起的高動力循環在PHT的維持中起重要作用。該研究旨在探討一氧化氮（NO）在PHT發病機理中的作用以及一氧化氮合酶（NOS）基因治療PHT的效果。

該研究從分子水平系統闡明了NO在PHT發病機理中的重要作用，進一步闡明了PHT的發病機理；首次應用免疫豁免原理進行FasL-NOS聯合基因治療PHT的研究，為PHT的治療開辟了新的途徑。對NOS基因治療PHT目前還停留在動物實驗階段，進入臨床應用尚存在治療效果的評價、基因治療的安全性和治療效費比等問題。

導入人組織激肽釋放酶基因治療腎性高血壓實驗研究

項目簡介：該項目利用基因工程技術，提取正常人胰腺組織RNA，采用oligo（dT）引物進行RT-PCR。回收PCR產物，插入質粒KS。利用高保真pfu Taq酶擴增激肽釋放酶基因片段，產物酶切處理后，和不同載體片段用T4連接酶連接，完成原核、真核載體的構建。將連接產物轉化、轉染不同的細菌、細胞，篩選克隆，按照不同載體的要求，選擇最佳的實驗條件進行人胰腺激肽釋放酶的表達。應用改良的電位滴定法，分析重組人胰腺組織激肽釋放酶活性。項目克隆人組織激肽釋放酶基因并進行序列分析，構建人組織激肽釋放酶基因表達載體，篩選高效表達菌株，進行重組人組織激肽釋放酶的制備及活性分析。

基因聯合放療、化療、免疫對結直腸癌復發轉移治療研究

項目簡介：該項目針對了臨床實體腫瘤治療的重點與難點和目前基因治療方法上的缺陷和不足。將基因治療與放療、化療和免疫治療相結合，為結直腸癌局部復發、轉移和其他實體瘤的治療提供了新的手段和方法，也為腫瘤基因治療的臨床應用探索了新途徑。采用雙啟動子調控目的基因的表達，提高了基因治療的靶向性和安全性。放射線促CD基因轉染刺激DCs激活T細胞的作用可用于制備腫瘤疫苗，提高腫瘤疫苗的安全性和特異性。該研究結果為進一步研發具有自主知識產權的針對結直腸癌復發和轉移的重組雙啟動子調控自殺基因治療藥物奠定了實驗基礎。

株單純皰疹病毒胸苷激酶基因及其應用

項目簡介：該技術應用于惡性腫瘤基因治療。以Ⅰ型中國株單純皰疹病毒（HSV-I)的DNA為模板，用PCR技術克隆到中國的單純皰疹病毒胸苷激酶基因，命名為HSV Ⅰ-TKc；構建含TKc基因的重組逆轉錄病毒載體pLTKcSN，轉導PA317包裝細胞，建立能產生還TKc基因假型逆轉錄病毒的病毒包裝細胞pLTKcSN/VPC(VPC為病毒載體生產細胞），并測定細胞上清液中病毒滴度；在此基礎上，運用PA317（pLTKcSN）包裝細胞株配合GCV模擬臨床過程來治療實體腫瘤，取得了一定效果。