小麥銹菌夏孢子經鹽酸處理后的形態觀察

陳萬權　劉太國　余秀梅

摘要為了快速區分小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌，用不同濃度的鹽酸處理3種小麥銹菌的新鮮夏孢子和在4℃冰箱內保存4個月以上的銹菌夏孢子，在顯微鏡下觀察夏孢子形態以及原生質體變化。結果表明，24.5％、28.5％、32.5％、36.5％4種濃度的鹽酸處理條銹菌夏孢子后其原生質體均濃縮成多個分散的小團。而同樣方法處理葉銹菌和稈銹菌新鮮菌種時其原生質體濃縮成一個大團或多個小團，濃縮成一個大團的比例隨鹽酸濃度的增大而提高；用不同濃度鹽酸處理保存4個月以上的2種小麥銹菌時，95％以上的夏孢子原生質體濃縮成多個分散的小團，少數(不超過5％)的夏孢子原生質體濃縮成一個大團。研究還發現葉銹菌和稈銹菌夏孢子活力、鹽酸濃度等對夏孢子原生質體濃縮狀況有很大影響，且與病菌生理小種有一定的關系。因此，銹菌夏孢子經36.5％濃鹽酸處理后的原生質體濃縮狀況只能作為小麥銹病田間快速診斷檢測的輔助手段，不能作為銹病種類鑒別的唯一標準，必須結合病害癥狀特征、孢子形態以及分子生物學方法等進行綜合判別。

關鍵詞小麥銹菌；夏孢子形態；病害診斷；原生質體；鹽酸

中圖分類號S 435.121

小麥條銹病(Puccinia striiformis f.sp.triti-ci)、葉銹病(P.triticina)和稈銹病(P.graminis f. sp.tritici)是我國小麥生產上經常發生危害的一類重要真菌病害。其中，以小麥條銹病流行范圍最廣、成災頻率最高，近年來在我國西南、西北麥區連年流行成災；其次是葉銹病，在我國許多麥區均有分布，但危害不如條銹病嚴重；稈銹病近30年來在我國基本得以持久控制，僅在西南、東北、蘇北等局部地區有發生和危害，然而，1999年在烏干達發現的小麥新型稈銹菌致病小種(Ug99)有傳入我國的潛在風險，對我國廣大麥區小麥安全生產亦構成極大威脅。準確鑒別小麥上發生的3種銹病，是進行病害早期預警和有效防控的基礎和前提。

長期以來，小麥3種銹病的癥狀特點是進行田間診斷的主要依據。生產實踐證明，在田間小麥苗期發病嚴重時，小麥條銹病和葉銹病的癥狀有時容易混淆，難以準確判斷。在某些田間條件下葉銹病的夏孢子堆有時也呈現鮮黃色，條銹病病斑有時也成不規則的排列。雖然小麥銹病專家能夠從癥狀上非常準確而迅速地區分出3種銹病，但對于一些基層農業科技工作者、育種工作者以及小麥生產者則不能很好地將三者區分開來。近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，已成功研發出基于PCR技術的銹病診斷檢測技術。例如，中國農業科學院植物保護研究所采用PCR方法，建立了以β－微管蛋白序列為基礎的小麥條銹菌和葉銹菌特異性分子診斷檢測技術；美國明尼蘇達大學采用RT-PCR的方法，建立了以病菌ITS1序列為區分標準的小麥3種銹菌的檢測技術；西北農林科技大學亦采用PCR方法，建立了直接從受感染的小麥葉片中區別條銹菌的檢測技術。該類建立在核酸技術基礎上的銹菌分子鑒定技術大大提高了病害診斷檢測的準確性和可靠性。但亦存在過程繁瑣、需要特殊設備和耗時費力等不足，基層農業科技工作者不易掌握、運用，因此，目前尚未在生產上大量推廣應用。本項研究采用濃鹽酸處理銹菌夏孢子，在顯微鏡下觀察夏孢子的質壁分離情況，探索根據夏孢子對濃鹽酸的不同反應進行銹菌種類鑒定、判別技術方法。現將研究結果報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

供試菌種為小麥3種銹菌的流行小種，均由中國農業科學研究院植物保護研究所提供。條銹菌用條中29號、條中31號、條中32號、水源11-14等；葉銹菌用PHK、THT、PHT、THP等；稈銹用21C3、34C2、RKR、MCB和BFM等。試驗過程中，除選用在小麥葉片上擴繁的新鮮夏孢子外，還用在4℃冰箱內保存4個月以上的老菌種做參照。

1.1.2試劑、儀器

36.5％濃鹽酸(分析純)由北京化工廠生產，加蒸餾水稀釋成32.5％、28.5％、24.5％、20.5％、12.5％、4.5％濃度梯度，保存于棕色試劑瓶中備用。萬能顯微鏡(BH-Z，日本OLYNPUS)由植物病蟲害生物學國家重點實驗室提供。

1.2試驗方法

供試條銹菌、葉銹菌和稈銹菌菌種分成兩組，一組是將銹菌夏孢子接種在高感品種銘賢169上繁殖，收集新鮮夏孢子菌種備用；另一組是直接選用在4℃冰箱內保存4個月以上的老菌種作對比研究。

用接種針挑取少量銹菌夏孢子粉，分別放置于滴有不同濃度鹽酸的載玻片上，鹽酸濃度分別4.5％、12.5％、20.5％、24.5％、28.5％、32.5％、36.5％，使銹菌夏孢子在鹽酸溶液中充分散開，蓋上蓋玻片，立即在10倍和40倍顯微鏡下觀察質壁分離現象，并拍照。在視野中隨機選取100個左右處理后的夏孢子，統計其原生質體濃縮或分塊情況，計算出原生質體濃縮和分塊百分比。試驗以清水處理作為對照。

2結果與分析

2.1小麥3種銹菌夏孢子在清水中的形態觀察結果

小麥條銹菌、葉銹菌、稈銹菌夏孢子經清水處理后，在顯微鏡下直接觀察其形態分特征(圖1a、c和e)。顯微觀察結果表明，無論是新鮮的夏孢子還是在4、℃冰箱內存放4個月以上的夏孢子，3種銹菌在清水處理中均未發生原生質體收縮現象。條銹菌夏孢子單細胞，球形或圓形，淡黃色，表面有微刺，發芽孔排列不規則；葉銹菌夏孢子單細胞，圓形或近圓形，黃褐色，有6～8個散生的發芽孔，表面有微刺；稈銹菌夏孢子單細胞，橢圓形，暗褐色，中部有4個發芽孔，孢壁上有明顯棘狀突起。條銹菌和葉銹菌夏孢子在清水中孢子大小、形狀、顏色等差異較小，在顯微鏡下直接鑒定比較困難。

2.2小麥3種銹菌夏孢子經鹽酸處理后的形態觀察結果

小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌夏孢子分別經濃度為4.5％、12.5％、20.5％、24.5％、28.5％、32.5％、36.5％的鹽酸處理后，鏡檢夏孢子原生質體濃縮和分塊情況。結果發現，4.5％、12.5％和20.5％鹽酸處理的3種銹菌夏孢子均未發生原生體濃縮或分塊現象。經24.5％、28.5％、32.5％和36.5％鹽酸處理后，銹菌夏孢子對鹽酸的反應有所不同，有的夏孢子原生質體收縮成多個分散的小團，有的在孢子中央濃縮成一個大團(圖1)。不同銹菌種類和生理小種對不同濃度鹽酸的反應結果列于表1。

從表1可以看出，小麥條銹菌所有供試小種在24.5％、28.5％、32.5％和36.5％鹽酸中均發生原生質體濃縮現象，不論新老菌種的夏孢子其原生質體均濃縮為多個分散小團(圖1b)，條銹菌不同生理小種對24.5％～36.5％濃度鹽酸的反應未表現出差異。葉銹菌和稈銹菌對鹽酸的反應則不然，有的夏孢子原生質體濃縮

成一個大團，有的濃縮成多個分散的小團(圖1d、f)。

從表1還可看出，葉銹菌和稈銹菌原生質體濃縮狀況受夏孢子活力、鹽酸濃度等影響較大，且不同生理小種亦存在一定的差異。在4℃冰箱內保存4個月以上的葉銹菌和稈銹菌老菌種，其夏孢子對4種濃度鹽酸的反應與條銹菌相似，有95％以上夏孢子的原生質體濃縮成多個分散的小團，僅有不足5％的夏孢子原生質體濃縮成一個大團，且受鹽酸濃度的影響不大。然而，新鮮的小麥葉銹菌在28.5％、32.5％和36.5％鹽酸中大多數夏孢子原生質體都濃縮成一個大團，且隨著鹽酸濃度的增加，濃縮成一個大團的比例亦增高，在36.5％的濃鹽酸中濃縮成一個大團的比例為76.6％～85.9％(平均82.3％)；在24.5％低濃度鹽酸中有50％以上的夏孢子原生質體濃縮成多個小團。由此可見，夏孢子活力以及鹽酸濃度對葉銹菌原生質體濃縮狀況有較大影響。此外，葉銹菌不同生理小種其夏孢子原生質體濃縮狀況也表現出一定差異，例如，在36.5％的濃鹽酸中，葉銹小種THT濃縮成一個大團的比例為85.9％，而THP僅為76.6％。同樣地，新鮮的小麥稈銹菌在36.5％的濃鹽酸中，夏孢子原生質體濃縮成一個大團的比例分別為63.0％和86.5％，僅有13.5％和37.0％的夏孢子原生質體濃縮成多個分散的小團，不同生理小種同樣表現出一定的差異。但在24.5％低濃度鹽酸中，其原生質體濃縮狀況則截然不同，99％的夏孢子原生質體濃縮成多個分散的小團，僅有個別夏孢子原生質體濃縮成一個大團，這與小麥條銹菌的狀況相似。

3結論與討論

小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌夏孢子在顯微鏡下鏡檢的形態有所不同。稈銹菌夏孢子為橢圓形、暗褐色，新鮮夏孢子用濃鹽酸處理后大多數孢子的原生質體在孢子中央濃縮成一個大團，少數孢子濃縮成多個分散的小團；條銹菌和葉銹菌夏孢子均為圓形、淡黃色或黃褐色，但條銹菌夏孢子經36.5％濃鹽酸處理后原生質體全部濃縮成多個分散的小團，而大多數新鮮葉銹菌夏孢子原生質體濃縮成一個大團，部分濃縮成多個分散的小團。用此法可方便、快速地進行銹病種類輔助鑒別，且成本低、操作簡便，便于基層農業科技工作者掌握運用，可作為小麥銹病田間快速診斷檢測的輔助手段。然而，研究亦發現葉銹菌和稈銹菌夏孢子活力、生理小種、鹽酸濃度等對夏孢子原生質體濃縮狀況有較大影響，特別是葉銹菌和稈銹菌夏孢子的新鮮程度對原生質體濃縮狀況影響很大。因此，銹菌夏孢子經濃鹽酸處理后的原生質體濃縮現象不能作為銹病種類鑒別的唯一標準，必須結合病害癥狀特征、孢子形態以及分子生物學方法等進行綜合判斷。