蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌抑制效果的研究

馬麗娟　周寶利　張淑紅　付亞文

摘要從蛇床子中提取抑制黃瓜枯萎菌的活性成分，正交優(yōu)選提取條件，并在不同濃度下測(cè)定其抑制效果。結(jié)果表明，在室溫下，95％乙醇連續(xù)超聲提取3次，每次45 min為宜；當(dāng)提取物濃度為10 mg/mL時(shí)，菌絲生長抑制率達(dá)78.65％；濃度大于100 mg/L時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率為100％；濃度為8 mg/mL時(shí)，相對(duì)防效為40.95％。

關(guān)鍵詞黃瓜；枯萎病菌；植物提取物；蛇床子；抑菌活性

中圖分類號(hào)S 436.421

黃瓜枯萎病[Fusarium oxysporum (Schl.)f.sp.cucumerinum Owen]是設(shè)施栽培中常見的土傳病害，在我國普遍發(fā)生。一般年份發(fā)病率在20％～35％，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)。傳統(tǒng)防治方法造成的“3R”(resistance，resurgence，residue)現(xiàn)象，使人們轉(zhuǎn)向研究以“環(huán)境友好的天然農(nóng)藥”來替代化學(xué)合成農(nóng)藥。利用天然植物提取物的抑菌作用來防治園藝作物真菌性病害，是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，蛇床子提取物有一定的殺蟲抑菌作用。目前，國內(nèi)外有關(guān)蛇床子提取物的研究主要在醫(yī)學(xué)與蛇床子素抑菌方面，針對(duì)某種特定病菌的抑菌有效性研究尚少見報(bào)道。

本研究是在試驗(yàn)篩選的基礎(chǔ)上，以蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎菌的抑菌效果為指標(biāo)，對(duì)蛇床子的超聲波提取工藝條件設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)。細(xì)分不同濃度提取物，對(duì)黃瓜枯萎病菌的室內(nèi)外抑制效果進(jìn)行研究。本試驗(yàn)通過天然植物蛇床子提取物的抑菌作用來提高黃瓜對(duì)枯萎病的抗性，對(duì)植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用具有一定實(shí)用價(jià)值。

1材料與方法

1．1供試材料

供試黃瓜枯萎菌(F.oxysporum f.sp.cu-cumerinum)取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，按照柯赫氏法則對(duì)其進(jìn)行分離鑒定。黃瓜品種為津春4號(hào)，采用基質(zhì)栽培，常規(guī)管理。蛇床子(Fructuscnidii)購自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院，粉碎過40目篩(孔徑0.37 mm)后備用。化學(xué)試劑均為分析純。所用培養(yǎng)基為馬鈴薯(瓊脂)蔗糖PSA/PS培養(yǎng)基。試驗(yàn)對(duì)照農(nóng)藥為15％多·混氨酮懸浮劑(金吉爾滅萎)購自沈陽市金點(diǎn)園藝有限公司。

1．2研究方法

1．2．1提取方式的篩選

為了系統(tǒng)考察蛇床子中對(duì)黃瓜枯萎病抑制活性物質(zhì)的提取工藝，根據(jù)蛇床子有效成分的性質(zhì)設(shè)計(jì)了因素與水平(表1)。

測(cè)定方法同1．2．2。

1．2．2蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎菌菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法，測(cè)定蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎菌菌絲生長的影響。將1 mL植物提取物加入到49 mL已融化并冷卻至40℃的PSA滅菌培養(yǎng)基中，混合均勻后制成平板，以純PSA培養(yǎng)基作為對(duì)照(CK₀)，藥劑500倍液為對(duì)照1(CK₁)，95％乙醇為對(duì)照2(CK₂)，每處理重復(fù)4次。在無菌條件下，接種d=0.638 cm經(jīng)純培養(yǎng)的枯萎菌菌絲圓片，24℃下暗培養(yǎng)，4 d后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

菌絲生長抑制率=1-[(對(duì)照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對(duì)照菌落生長直徑]×100％。

1．2．3蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎菌孢子萌發(fā)的影響

采用孢子懸滴培養(yǎng)法，測(cè)定蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎菌孢子萌發(fā)的影響。分生孢子懸浮液的制備：在已滅菌的200 mL PS培養(yǎng)基中接入4片d=0.638 cm經(jīng)純培養(yǎng)的枯萎菌菌絲圓片，在振蕩培養(yǎng)箱中24℃振蕩培養(yǎng)14 d，過濾離心，取下層孢子溶液用無菌水稀釋，在低倍顯微鏡下一個(gè)視野約50個(gè)孢子，約為1×10⁵個(gè)/mL，放入冰箱中備用。

將不同濃度提取物分別稀釋50倍，取10μL稀釋液與10μL黃瓜枯萎菌分生孢子懸浮液于載玻片上混合(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)，經(jīng)24℃保濕懸滴培養(yǎng)，16 h后鏡檢，記錄孢子萌發(fā)數(shù)量和總孢子數(shù)量，計(jì)算萌發(fā)率。以清水處理作為空白對(duì)照(CK₀)，藥劑500倍液為對(duì)照1(CK₁)，95％乙醇為對(duì)照2(CK₂)，每處理重復(fù)6次。

孢子萌發(fā)率=(孢子萌發(fā)數(shù)量/總孢子數(shù)量)×100％。

1．2．4蛇床子提取物對(duì)田間黃瓜枯萎病發(fā)病情況的影響

試驗(yàn)于2007年3月中旬至6月初進(jìn)行。經(jīng)溫湯浸種后將種子播于育苗盤。待子葉展平，且露真葉時(shí)，分苗于12 cm×12 cm育苗缽中。當(dāng)四葉一心時(shí)，對(duì)植株進(jìn)行傷根接菌，每株50 mL濃度為l×10⁶個(gè)/mL的分生孢子懸浮液。接菌5 d后，分別用濃度為1、2、4、8 mg/mL的植物提取物處理幼苗，每株25 mL，共處理4次，每次間隔3天，以清水處理作為空白對(duì)照(CK₀)，澆25 mL15％多·混氨酮懸浮劑500倍液為對(duì)照1(CK₁)，最后一次處理后第3天調(diào)查發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)及其相對(duì)防治效果。每個(gè)濃度處理10株苗，3次重復(fù)。

黃瓜枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

O級(jí)：全株無病；工級(jí)：發(fā)病輕微，全株有1/4以下的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；Ⅱ級(jí)：發(fā)病較重，全株有1/4～1/2的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；Ⅲ級(jí)：發(fā)病重，全株有1/2以上的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；Ⅳ級(jí)：因病枯死或接近死亡。

發(fā)病率=(發(fā)病植株數(shù)量/調(diào)查植株數(shù)量)×100％；

病情指數(shù)=[∑(病級(jí)株數(shù)×發(fā)病等級(jí))/(調(diào)查總株數(shù)×最高等級(jí)代表值)]×100；

相對(duì)防效=[(對(duì)照病情指數(shù)一處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100％。

2結(jié)果與分析

2．1正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果

根據(jù)L₉(3⁴)正交試驗(yàn)的排列組合(表2)。各取蛇床子10 g，共9份，精密稱量，隨機(jī)取樣編號(hào)為1～9號(hào)，按每個(gè)試驗(yàn)號(hào)的要求進(jìn)行試驗(yàn)。用10 mL95％乙醇定容。提取液與蛇床子粉末的比例為5倍劑量。

由表2可以看出R_A＞R_C>R_D>R_B。由此可知，提取藥劑是影響提取率的重要因素，其次為提取次數(shù)和提取時(shí)間，影響相對(duì)較小的因素是提取溫度。再根據(jù)K值進(jìn)行分析得出，A₃優(yōu)于A₁、A₂；B₁優(yōu)于B₂、B₃C₃優(yōu)于C₂、C₁；D₃優(yōu)于D₁、D₂。因此，蛇床

子抑制黃瓜枯萎菌活性成分提取工藝條件為A₃B₁C₃D₃。

將測(cè)得的蛇床子抑菌直徑進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從方差分析結(jié)果可知，A、C和D因素在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義(p＜0.05)，可以選擇與這三因素相關(guān)的提取工藝。B因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，選任意水平均可，但從節(jié)約能源和成本方面考慮，選1水平為好。綜上所述，從水平和測(cè)試項(xiàng)目分析可得最佳提取條件為A₃B₁C₃D₃，即以95％乙醇為提取溶劑，采用室溫超聲提取。提取3次，每次45 min。合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，以10 mL 95％乙醇定容，所得粗提物濃度為1 g/mL。

2．2蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

表4數(shù)據(jù)顯示，不同濃度植物提取物對(duì)菌絲生長抑制率均在50％以上，并隨著濃度的升高抑制能力逐漸加強(qiáng)。在提取物濃度為10 mg/mL時(shí)抑制率為78.65％，比藥劑對(duì)照抑制率低4.26％，濃度為20 mg/mL時(shí)抑菌能力有所減弱。當(dāng)提取物濃度為100 mg/L時(shí)，黃瓜枯萎菌孢子萌發(fā)抑制率為100％，隨著濃度的增大病菌孢子同樣不能萌發(fā)，結(jié)果同藥劑處理。95％乙醇對(duì)黃瓜枯萎菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)都存在一定的抑制作用，其對(duì)孢子抑制率為36.7％。

2．3蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎病田間發(fā)病情況的影響

由表5可以看出，津春4號(hào)黃瓜品種自身對(duì)枯萎病有較強(qiáng)的抗性，空白對(duì)照的發(fā)病率僅為48.39％。在此基礎(chǔ)上，澆灌植物提取物，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，發(fā)病率為40％，且隨著施用濃度的增大發(fā)病率逐漸減小。當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí)，發(fā)病率為26.67％，與藥劑對(duì)照相差約6％，病情指數(shù)相差近10％。相對(duì)防治效果也隨著提取物濃度的加大而升高。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，相對(duì)防效僅為8.15％，但當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí)，相對(duì)防效達(dá)40.95％。

3討論

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床[Cnidiummonnieri(L.)Cusson]的干燥成熟果實(shí)，主要含有揮發(fā)油及蛇床子素等香豆素類成分。傳統(tǒng)提取方法采用水煎煮、醇提或石油醚提取，提取能力差，有效成分損失嚴(yán)重，雜質(zhì)多。超聲提取原理主要是利用超聲的空化作用對(duì)細(xì)胞膜的破壞，有助于有效成分的溶出和釋放，且其具有提取速度快、時(shí)間短、收率高、無需加熱等特點(diǎn)。試驗(yàn)表明，提取溶劑對(duì)天然植物有效成分的提取有著重要作用。且在提取溶劑總量不變的情況下，多次提取更有利于活性成分的滲出，但與提取時(shí)間長短關(guān)系不顯著。本工藝有利于蛇床子抑制黃瓜枯萎菌有效成分的提取，且操作簡便易行，適合于今后近一步研究并應(yīng)用于園藝作物生產(chǎn)。

黃瓜枯萎病是設(shè)施黃瓜生產(chǎn)上的重要病害，近年來由于設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大，其發(fā)病趨勢(shì)也隨之加大。本試驗(yàn)以蛇床子提取物抑制黃瓜枯萎病菌，在所設(shè)濃度內(nèi)對(duì)菌絲生長抑制率均在50％以上，當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)抑制率為78.65％，高于其他濃度。這說明抑制有效濃度在此范圍內(nèi)，提高濃度則效果不顯著。在濃度為100 mg/L時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用，表現(xiàn)為孢子畸形生長。95％乙醇對(duì)照亦能在一定程度上抑制黃瓜枯萎菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，但對(duì)比植物提取物和藥劑仍有明顯的差距。藥劑對(duì)照與所設(shè)濃度最高抑制率相差4％，說明生物抑菌有很大的研究價(jià)值和發(fā)展空間。

結(jié)合抗病品種津春4號(hào)的遺傳優(yōu)勢(shì)，以天然植物蛇床子提取物灌根處理幼苗，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，相對(duì)防效僅為8.15％。但隨著澆灌濃度的增大，相對(duì)防效以10％以上的梯度遞增，當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí)增長稍緩，濃度為8 mg/mL時(shí)相對(duì)防效達(dá)到40.95％，且有一定的增長空間。關(guān)于田間施用的最佳提取物濃度還有待進(jìn)一步深入研究。