殼聚糖對胃潰瘍大鼠血清中ＭＤＡ、ＳＯＤ及ＧＳＨ－ＰＸ的影響

摘 要 目的：觀察殼聚糖對大鼠消化性潰瘍愈合的影響，探討其抗潰瘍的可能機制。方法：采用冰乙酸胃竇部漿膜下注射法制備大鼠消化性潰瘍模型。70只實驗大鼠被隨機分成7組，即假手術對照組、模型對照組、泮托拉唑治療組、硫糖鋁混懸液治療組及3個不同劑量殼聚糖治療組（ 0.25 g/kg，0.5 g/kg，1.0 g/kg）。按Guth標準記分判定潰瘍指數并計算潰瘍抑制率；HE染色觀察組織結構。采用羥胺法測定超氧化物岐化酶(SOD)，DTNB法測定谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)，TAB法測定丙二醛(MDA)。結果：殼聚糖治療組與模型對照組比較，潰瘍指數明顯降低，潰瘍抑制率升高（P < 0.01)；1.0 g/kg殼聚糖治療組大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px值與模型對照組均有顯著性差異（P<0.05）； 0.25 g/kg殼聚糖治療組及0.5 g/kg殼聚糖治療組大鼠血清MDA值與模型對照組比較均有顯著性差異（P< 0.05），但SOD、GSH-Px值與模型對照組比較均無顯著性差異。結論：殼聚糖可促進冰乙酸潰瘍大鼠的潰瘍愈合，并呈一定的量效關系。其促進潰瘍愈合作用可能與抗氧化機制有關。

關鍵詞 胃潰瘍 殼聚糖 抗氧化作用

中圖分類號：R97 文獻標識碼：B 文章編號：1006-1533(2008)05-0219-04

Effect of chitosan on the serum levels of MDA， SOD， and GSH-Px in rats with gastric ulcer

Qu Chunying， Li Dingguo， Wang Yuqin， Chen Meimei

(Xinhua Hospital of Medical Instite of Shanghai Jiaotong University， Shanghai，200092)

ABSTRACT Aim:

To observe the effect of chitosan on the healing of gastric ulcer and explore the possible mechanisms for its action. Methods: Glacial acetic acid was subserosally injected to the gastric antrum of rats to establish the animal model of gastric ulcer. Seventy rats were randomly divided into 7 groups: sham-operated group， model group， pantoprazole-treated group， sucralfate-treated group， and three chitosan-treated groups at low， moderate and high doses (0.25， 0.5， and 1.0 g/kg). The ulcer index was evaluated by Guth method and the inhibition ratio of ulcer formation was calculated. The morphological changes were observed by HE staining. The levels of superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GSH-Px)，and malondialdehyde (MDA) were determined by hydroxylamine method， DTNB method and TAB method respectively. Results: The ulcer index was significantly decreased and the inhibition ratio of ulcer formation was significantly increased in chitosan-treated groups compared with model group (P<0.01). The serum levels of MDA， SOD and GSH-Px in chitosan 1.0 g/kg group had significant difference compared with those of model group (P<0.05). The serum level of MDA in chitosan 0.25 g/kg group and 0.5 g/kg group were significantly different with that of model group (P<0.05)， but there was no significant difference in the serum levels of SOD and GSH-Px among chitosan 0.25 g/kg group and 0.5 g/kg groups and model group. Conclusion: Chitosan may improve the healing of gastric ulcer induced by glacial acetic acid in rats. The effect was in a dose-dependent manner. The action mechanism of chitosan may be related with its antioxidant activities.

KEY WORDS Ulcer; Chitosan; Antioxidant activity

消化性潰瘍是一類常見病、多發病。隨著藥物治療的進展，消化性潰瘍的愈合率也日趨提高，但不能避免復發。

殼聚糖由甲殼素加工而成，對人體安全無毒［1～3］，可生物降解，具有良好的生物相容性。殼聚糖的水解產物是表皮細胞或組織生長必需的生物活性物質，有利于潰瘍局部肉芽組織和新生血管的形成；殼聚糖分子中含有極性基團并帶正電荷，溶解于胃酸，形成黏稠的膠，附著在胃壁上形成一層保護膜，阻止胃酸和胃蛋白酶對潰瘍面的腐蝕，促進潰瘍修復和愈合。國內外動物實驗證實［4～9］，殼聚糖有保護胃黏膜、促進胃潰瘍愈合作用。本文對殼聚糖抗潰瘍的可能機制作一研究。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：雄性Sprague-Dawley系大鼠，體重190～250 g，共70只，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司。

藥物：殼聚糖，脫乙酰度92%，華東理工大學提供；泮托拉唑鈉腸溶片，沈陽東宇藥業有限公司生產；硫糖鋁混懸液，上海旭東海普藥業有限公司生產。

試劑：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、丙二醛(malonaldehyde，MDA) 測試盒及谷肽甘肽-過氧化物酶 (glutathione peroxidase ，GSH-Px) 測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備

70只實驗大鼠隨機分成7組，每組10只。分別為：假手術對照組；模型對照組；泮托拉唑治療組；硫糖鋁混懸液治療組；0.25 g/kg殼聚糖治療組；0.5 g/kg殼聚糖治療組；1.0 g/kg殼聚糖治療組。大鼠消化性潰瘍模型制備采用冰乙酸胃竇部漿膜下注射法［10］。大鼠造模前24 h禁食不禁水，用氯胺酮2 mg/kg腹腔注射麻醉，自劍突下0.5 cm縱向切開腹壁2cm，使胃暴露，用微量注射器在胃前壁胃竇部漿膜下近肌層處注入15%冰乙酸0.05 mL，后回納胃并覆蓋網膜，間斷縫合腹膜、腹壁各層。假手術對照組用微量注射器在胃前壁胃竇部漿膜下近肌層處注入0.9%生理鹽水0.05 mL代替冰乙酸。

1.2.2 給藥

各組大鼠造模后第2日起自由飲食，第3日起給藥，每日上午9時灌胃給藥， 每日1 次， 總療程 10日。1)假手術對照組：以生理鹽水灌胃；2)模型對照組：以生理鹽水灌胃；3)泮托拉唑治療組： 以20 mg/(kg·d)泮托拉唑灌胃；4)硫糖鋁混懸液治療組: 以200 mg/(kg·d)硫糖鋁混懸液灌胃；5)0.25 g/kg殼聚糖治療組：以0.25 g/(kg·d)殼聚糖灌胃；6)0.5 g/kg殼聚糖治療組：以 0.5 g/(kg·d)殼聚糖灌胃；7)1.0 g/kg殼聚糖治療組：以1.0 g/(kg·d)殼聚糖灌胃。實驗過程中， 1.0 g/kg殼聚糖治療組死亡2 只， 1只因造模手術感染致死， 另1只在藥物灌胃時嗆死。

1.2.3 取材

末次給藥后各組大鼠禁食不禁水24 h，給予1 %戊巴比妥鈉 (30 mg/ kg) 腹腔內注射麻醉后，門靜脈取血靜置2~3 h后分離血清，置EP管于-20 ℃冰箱中保存待測。同時取下胃，沿胃大彎剪開，固定在泡沫平板上，用冰生理鹽水沖洗，置于2%甲醛溶液中固定10 min，仔細觀察每只大鼠的黏膜損傷情況 ，用游標卡尺測量，按Guth標準記錄。留取距潰瘍邊緣 2～3 mm的胃組織，沿經潰瘍中心的最長軸的中點縱切，若無潰瘍 ，則在相同部位切取1.0 cm×1.0 cm大小的胃組織置于10%甲醛溶液中固定24 h，按照常規脫水，石蠟包埋。

1.2.4 潰瘍程度評定

Guth標準記分——點狀出血記1分；線狀出血，若寬度<1 mm，糜爛長度<1 mm記2分，1~2 mm記3分，2~4 mm記4分，>4 mm記5分；若寬度>1 mm，以上分值×2。

潰瘍抑制率：潰瘍抑制率= (模型對照組潰瘍指數- 治療組潰瘍指數)/ 模型對照組潰瘍指數×100%。

組織學檢查：大鼠胃組織以10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，連續切片（4 μｍ），HE染色觀察組織結構。

血清學檢查：SOD測定方法，采用羥胺法；GSH-Px測定方法，采用DTNB法；MDA測定方法，采用TAB法。

1.3 統計分析

應用SPSS12.0統計軟件，計數資料以 ±s表示。多組間比較采用方差分析，組間差異采用Newman-Keuls法，P值< 0.05為差異有顯著性。偏態分布計量資料結果用四分位數表示，組間變量比較用多個獨立樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法），P值< 0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 潰瘍指數

如表1所示，各藥物治療組潰瘍指數較模型對照組都明顯降低 (P< 0.01) ，其中又以泮托拉唑治療組及1.0 g/kg殼聚糖治療組潰瘍指數值最低。

2.2 組織學檢查

HE染色：可見假手術對照組大鼠胃黏膜形態規則的黏膜上皮層、固有膜和黏膜肌層，在固有膜內分布有整齊的管狀胃腺，接近上皮區域形成胃小凹。模型對照組潰瘍灶表面無黏膜覆蓋，黏膜下層組織消失，代之以壞死組織及大量炎性細胞浸潤，肌層肌纖維結構不清，見有富含毛細血管的肉芽組織，內含有成纖維細胞、炎性細胞及巨噬細胞等，底部有瘢痕形成。各藥物治療組被覆黏膜形態呈現較大的差異：泮托拉唑治療組和1.0 g/kg殼聚糖治療組大多數潰瘍灶表面被覆黏膜已形成了上皮、固有膜和黏膜肌層，其黏膜厚度與皺襞接近正常黏膜，雖無胃腺形成，但這些組織的被覆確是潰瘍愈合的象征；硫糖鋁混懸液治療組和0.5 g/kg殼聚糖治療組潰瘍灶被覆黏膜多形成了完整的上皮和固有膜，但其黏膜厚度略薄；0.25 g/kg殼聚糖治療組潰瘍灶被覆黏膜形態最差，其被覆的薄層黏膜僅見上皮和少量固有膜，且皺襞粗大而不規則。

2.3 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px含量測定

如表2所示，1.0 g/kg殼聚糖組、硫糖鋁混懸液治療組及泮托拉唑治療組大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px值與模型對照組均有顯著性差異（P< 0.05）；0.25 g/kg殼聚糖組及0.5 g/kg殼聚糖組大鼠血清MDA值與模型對照組比較均有顯著性差異（P< 0.05），但SOD、GSH-Px值與模型對照組比較均無顯著性差異。

3 討論

氧自由基是具有非偶電子的基團和分子，是正常生化過程中的中間產物。在正常情況下，機體在代謝過程中產生的自由基代謝產物及其清除系統保持著動態平衡；SOD和GSH-Px是清除體內氧自由基的一組重要的酶，其活性下降會導致氧自由基代謝產物在體內的堆積。MDA是氧自由基氧化生物膜多不飽和脂肪酸產生的降解產物。其含量升高，反映了體內氧自由基代謝產物的增多。氧自由基在體內的堆積對細胞有明顯的損害作用，可以直接破壞細胞膜和遺傳結構，使具有膜結構的內質網、溶酶體及線粒體等結構破壞［12，13］。消化性潰瘍的發生也與氧自由基損傷有關，研究證實，在高原缺氧地區，SOD和GSH-Px活性明顯降低，而MDA含量顯著升高，因此在高原地區消化性潰瘍的發病率明顯高于平原［14～16］。高靜等［17］也發現消化性潰瘍患者血中MDA明顯升高，而SOD、GSH-PX活性均明顯低于正常對照組。

殼聚糖具有抗氧化作用，Tae等［18］研究顯示，殼聚糖可通過提高SOD酶的活力減輕四氯化碳介導的肝細胞損害。Anandan等［7］做的實驗顯示甲殼素及殼聚糖有促進鹽酸-乙醇潰瘍大鼠的潰瘍愈合作用，部分原因在于改善潰瘍黏膜的SOD、過氧化氫酶及GSH-Px等的活性。本實驗證實1.0 g/kg殼聚糖治療組可增強大鼠體內SOD及GSH-Px的活性，各劑量組殼聚糖均減少了氧化代謝產物MDA的含量，這意味著殼聚糖可能通過增強抗氧化酶的活性，減輕潰瘍局部炎癥介導的氧自由基損傷，進而促進潰瘍愈合。

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(收稿日期：2008-03-14)