綠色熒光蛋白的發現與發展

編者按：2008年諾貝爾自然科學獎頒布后，相關的介紹與報道鋪天蓋地。其中一條新聞很有意思，在諾貝爾化學獎得主下村修的出生地日本，養殖在一家水族館里的一種多管水母也一夜成名，吸引了無數人前來參觀，因為下村修正是從這種水母身上發現了后來讓他獲獎的綠色熒光蛋白。其實下村修本人的經歷，也如同這種水母一樣：作為綠色熒光蛋白的發現者，、幾十年來一直默默無聞，甚至他本人當初都沒有預見到該項發現的價值。如果不是后來幾位有技術、工程背景的研究人員在基礎研究和實際應用之間架起橋梁，這項發現恐怕還淹沒在論文堆中。與PCR(聚合酶鏈反應)技術一樣，又一項與生物和生命科學有重要相關的技術獲得了諾貝爾化學獎，這給化學家們，尤其是從事基礎研究的化學家們帶來哪些啟示呢?我刊約請中科院理化技術研究所吳世康研究員介紹綠色熒光蛋白及其發現過程。

2008年的諾貝爾化學獎授予了從事有關“綠色熒光蛋白質的發現，表達和發展”并取得重要成就的三位科學家：下村修、馬丁·查爾菲和錢永健。

綠色熒光蛋白及其發光機理

綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP)是一種在美國西北海岸所盛產的水母中所發現的一種蛋白質。這類學名為Aequorea victoria的水母有著美麗的外表，生存歷史超過1.6億年。1962年，下村修正是在這種水母的發光器官內發現天然綠色熒光蛋白。它之所以能夠發光，是因在其包含238個氨基酸的序列中，第65至67個氨基酸(絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸)殘基，可自發地形成一種熒光發色團。

當蛋白質鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質內部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經環化形成咪唑酮，并發生脫水反應。但此時還不能發射熒光，只有當有分子氧存在的條件下，發生氧化脫氫，方能導致綠色熒光蛋白發色團的“成熟”，形成可發射熒光的形式。上述綠色熒光蛋白發色團的形成過程，系由幾位科學家分別研究完成的。

綠色熒光蛋白不僅無毒，而且不需要借助其他輔酶，自身就能發光，可以讓科學家在分子水平上研究活細胞的動態過程。當綠色熒光蛋白的基因和我們感興趣的有機體內所擬研究的蛋白質基因相融合時，蛋白質既能保持其原有的活性，綠色熒光蛋白的發光能力也不受影響。通過顯微鏡觀察這種發光的“標簽”，科學家就能做到對蛋白質的位置、運動、活性以及相互作用等一目了然。在一個活體中有數萬種不同的蛋白質，這些蛋白質精細地控制著重要的化學進程。如果蛋白機制發生故障，通常就會t發生疾病。綠色熒光蛋白可幫助研究這類機制，這就是為什么綠色熒光蛋白成為生物科學極其重要的工具。在它的幫助下，科學家還能對各種細胞的命運了如指掌，比如，腦神經細胞是如何發育起來的，或者癌癥細胞是如何擴散的……

今天，已經有了許多新的不同的綠色熒光蛋白變體，這就進一步完善了綠色熒光蛋白作為基因標志在生物研究中的廣泛應用。

下村修與綠色熒光蛋白的發現

Aequorea victoria水母是一種生物發光體。1960年，下村修為搞清它的生物發光機制，參加了普林斯頓大學弗蘭克·約翰遜實驗室的工作。Aequorea victoria生物發光的活性組分曾被認為是一種與鈣離子相關聯的蛋白質，被稱為水母素(水母素現在仍是一種檢測生物體內鈣離子的方法之一)。但在此形式下，所發射的是藍光。對此，下村修曾做了大量的工作來說明所發射的熒光究竟是綠光還是藍光。研究人員分離了大量的蛋白質，都顯示出強烈的綠光，于是他在1962年寫道：“由蛋白質所得的溶液在日光下是稍稍發綠的，但在鎢燈下則為黃色，在紫外光下則呈現出很亮的、綠色的熒光”。應當說，對這一問題的認識是在不斷提高的。他們在無直接試驗證據的情況下，提出了綠色熒光蛋白所發的綠光是因受鈣激發而發光的水母素，其能量向綠色熒光蛋白發生了轉移所致。按現代的科學術語來說，水母素是作為一種能量給體，而綠色熒光蛋白則成為能量受體。這一觀點，后來得到了實驗的證實。但應當指出的是兩種色素是獨立存在的，并無依賴關系。

雖然綠色熒光蛋白最初只是水母素研究中的一項偶然發現的“副產品”，但總的說來，下村修在發現綠色熒光蛋白的過程中作出了重要的貢獻。如對其純化和物理化學表征等方面，以及在不同條件下的激發光譜和發射光譜的測定等，綠色熒光蛋白與水母素兩者間的能量轉移，并解釋了由綠色熒光蛋白發射的是綠光而不是藍光。如果沒有這些經典性開創工作，有關綠色熒光蛋白的出現和廣泛應用將推遲幾十年，甚至至今它仍作為一種秘密保留在太平洋中。

查爾菲把綠色熒光蛋白用于有機體

1985年，道格拉斯·普瑞舍克隆了水母素的基因。1992年，他又克隆出完整的由238個氨基酸編碼的綠色熒光蛋白基因。可惜的是，普瑞舍沒有進一步嘗試把該基因引入其他生物體內，雖然他在1992年的有關克隆工作的總結中最后指出：“迄今尚無可用的發色團生物合成的有關信息，而這種蛋白質的重組方式可以成為一種有價值的試劑，使我們可在這類特殊的蛋白質內，來試驗發色團生成的生物化學，以及在水母素和綠色熒光蛋白間的能量轉移機制等”。將綠色熒光蛋白表達到其他有選擇的有機體這項工作，具有重大的生物學意義。這就涉及馬丁·查爾菲的工作了。

馬丁·查爾菲所從事的研究是有關小線蟲神經細胞的發展。當查爾菲第一次聽說到綠色熒光蛋白時，他十分激動地從利用分子遺傳學方法來研究線蟲問題，轉移到將綠色熒光蛋白與有機體中蛋白質基因相融合的工作，并先后在兩種小線蟲中得到表達，即綠色熒光蛋白在不同的有機體中顯示出亮綠色的熒光，因此確認了綠色熒光蛋白可作為一種通用的基因標志，而應用于各種有機體中。接著，他還得到了綠色熒光蛋白在有機體內的不同部位和不同時間發展下的表達結果。1994年2月初查爾菲及其合作者把這些研究結果發表在《科學》雜志上，并引起轟動。

綠色熒光蛋白的熒光形式不僅可用以表達小線蟲、果蠅等，對哺乳動物的細胞也適用，從而使定量研究活細胞的動態過程成為可能。查爾菲等人的工作向人們展示出，綠色熒光蛋白作為一種通用的基因標志，在生物研究中有著無限的潛力。

錢永健的貢獻

錢永健和他的同事不僅加深了對綠色熒光蛋白發光機制的了解，比如分子氧的作用，由此可以解釋為什么綠色熒光蛋白在有機體內可容易地發射熒光。更重要的是發現了一些新的具有不同光譜行為的綠色熒光蛋白變體，從紫外部分一直位移到藍色。這些結果表明，綠色熒光蛋白在進行取代或進行化學轉換上是十分活潑的，而這些改進了的綠色熒光蛋白，為其在生物科學中的成功應用鋪設了一條康莊大道。

錢永健及其合作者，還解決了綠色熒光蛋白的晶體結構問題，從而允許能夠較合理地對具不同性質的變體合成進行設計。這些新變體有的熒光更強，有的呈黃色，有的呈藍色，有的呈紅色，有的可激活、可變色。這意味著除綠色以外，還可以用其他顏色熒光蛋白標示不同的蛋白質和細胞。今天，綠色熒光蛋白及其變體作為基因標志，已實現了工具化，有了通用的“工具盒”，可應用于所有生命體系中的科學研究。

在此筆者還想談一點感想。雖然這一獲獎項目為化學獎，但是它所涉及的大量工作都和生物和生命科學相關，包括所研究對象，以及它的實際應用等。這說明現代科學的分類已不拘泥于以往的格局。這還使我聯想到目前我們化學家對于物理和生物科學的生疏，以及物理學家見到苯環結構而害怕的情況。這些現狀表明，我們的大學教育確是有進一步改革的必要。

[責任編輯]龐云