中國野生葡萄抗黑痘病基因ＲＡＰＤ標記的克隆、序列分析及輔助育種應用張劍俠

摘要：對中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1300進行了克隆、測序及序列分析，結果表明該標記實際長度是1 354bp，因此更名為OPS03-1354，其GenBank登錄號為DQ350885。該標記序列與99條來自歐洲葡萄的EST有同源性。其中與1條來自赤霞珠葉片感染葡萄皮爾斯病病原菌后獲得的EST同源性為82％，與2條來自赤霞珠果實在不同發育期獲得的EST同源性分別為80％和85％。該序列與1條來自中國野生華東葡萄白河-35-1葉片接種霜霉病病原菌后獲得的EST同源性為67％。該序列編碼葡萄的一種假定蛋白。此外，應用該標記對中國野生葡萄與歐洲葡萄的種間雜交廣西-1×京可晶Fl代339株、白河-35-1×佳利釀F₂代207株進行了輔助選擇。

關鍵詞：中國野生葡萄；抗黑痘病基因；RAPD標記；克隆；序列分析；標記輔助育種

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2009)04-456－05

葡萄黑痘病[Elsinoe ampelina(de Bary)Shear]是葡萄上的一種重要真菌病害，通常危害葡萄的新梢、幼葉、花、果等，嚴重影響葡萄的生長及果實品質。在我國長江流域該病的危害較重，北方地區雨水較多的年份也能造成較大的經濟損失。歐洲葡萄品質優良，但抗病性差，多數品種易感黑痘病；而中國野生葡萄是重要的抗病種質資源，Wang等對中國原產的野生葡萄13種108個株系抗黑痘病的鑒定結果表明，它們均表現抗黑痘病。因此，利用中國野生葡萄的抗病性與歐洲葡萄進行種間雜交是培育抗病品種的有效途徑。但通過雜交獲得的雜種幼苗種植需要大量的土地，且對雜種基因型的選擇是依據其抗病表現型間接進行，需要大量的人力、資金和時間投入，育種周期長，效率低。分子標記技術為加快農作物育種提供了新方法，由于分子標記與目標性狀的基因相連鎖，因此利用分子標記可以對雜種的基因型進行直接選擇，從而可以提高育種效率。目前，分子標記在果樹上已有不少研究報道，而且一些標記已應用于輔助育種(Marker-assisted Breed-ing)。

隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術具有快速、簡便且不使用同位素等優點，因而在輔助育種方面得到廣泛的應用。我們是在前期研究獲得中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記POS03-1300的基礎上，對該標記進行克隆與測序以獲得序列全長，為將其轉換成穩定性、專一性更強的SCAR標記提供DNA分子依據；通過對其序列進行生物信息學分析，旨在了解其可能具有的功能，為進一步的研究奠定基礎。此外，結合對種間雜種抗黑痘病的田間鑒定結果，應用該標記對雜種幼苗進行輔助選擇，以加快育種進程。

1 材料和方法

1.1 材料

材料為西北農林科技大學葡萄種質資源圃中保存的種間雜交親本及其后代：廣西一1(抗病)×京可晶(感病)F₁代339株(2，004年雜交)，白河-35-1(抗病)×佳利釀(感病)F₂代207株(2002年由4個F₁。代抗病單株6-12-1、6-12-2、6-12-4、6-12-6分別自交獲得)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄基因組DNA的提取及RAPD反應體系葡萄基因組DNA提取方法及RAPD反應體系參照王躍進等的方法。Taq DNA聚合酶為洛陽華美生物公司產品，dNTPs、限制性內切酶EcoR I為TakaRa產品，隨機引物、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒為上海生物工程公司產品，pGEM-T Easy Vector試劑盒為Promega產品，分子量標準Marker-12為東勝生物科技有限公司產品。

1.2.2 RAPD標記的回收 用前期研究獲得中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1300的特異引物OPS03，分別對中國野生華東葡萄白河－35-1和歐洲葡萄佳利釀的基因組DNA進行RAPD擴增，擴增產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠上切取白河－35-1抗黑痘病基因的RAPD標記(DNA片段)，參照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明進行回收。

1.2.3 RAPD標記的克隆、測序 克隆方法參照文獻[14]，測序由上海生物工程公司完成。

1.2.4 RAPD標記序列的生物信息學分析 登錄NCBI (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用Blastn和Blastx工具，分別對獲得的抗黑痘病基因RAPD標記序列進行同源性比對。利用NCBI數據庫的ORFFinder功能，對RAPD標記序列進行開放閱讀框架分析。

1.2.5 RAPD標記輔助選擇 應用特異引物OPS03對雜種后代進行RAPD分析，RAPD擴增重復2次。對照田間抗黑痘病的鑒定結果，計算出抗黑痘病基因RAPD標記與田間抗病表現的符合率：表現抗病且存在RAPD標記的雜種株數+表現感病且不存在RAPD標記的雜種株數／雜交群體總株數。

2 結果與分析

2.1 中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1300的克隆、測序結果

對來自于中國野生葡萄白河-35-1抗黑痘病基因的RAPD標記OPS03-1300進行回收，經克隆和藍白斑篩選，提取質粒DNA，通過酶切鑒定證實為陽性克隆。陽性克隆的測序結果表明，該標記實際長度為1 354 bp(圖1)，因此將該標記重新命名為OPS03-1354。將該標記序列登錄GenBank，登錄號為DQ350885。

2.2 中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1354的生物信息學分析

對抗黑痘病基因特異標記OPS03-1354進行Blastn分析結果表明，有40條來自其他生物的DNA序列和OPS03-1354序列有部分相似性，相似性片段大小在21～25 bp，E值0.30～4.7>>1x105，同源性較小，這說明OPS03-1354可能是葡萄屬植物基因組特有的一段DNA序列。該標記序列與擬南芥(Arabidopsis thdiana)基因組DNA序列進行比較，與37條來自于擬南芥基因組的核酸序列有18～21bp個堿基的相似性，同源性較小。在EST數據庫中Blastn比對結果顯示，該標記序列與99條近年來登錄Genbanktlsl的歐洲葡萄全基因組鳥槍序列有同源性，介于66％～85％。其中，該序列與1條來自歐洲葡萄赤霞珠葉片感染葡萄皮爾斯病原菌(Xylella fas-tidiosa)后獲得的EST同源性較高，為82％；與2條赤霞珠果實在不同發育期獲得的EST同源性分別為80％和85％。該序列還與1條來自中國野生華東葡萄白河-35-1葉片接種霜霉病病原菌(Plasmoparaviticola)后獲得的EST同源性為67％。OPS03-1354共有7個開放閱讀框架(ORF)，最大的一個ORF在878～618堿基，包含261個堿基(圖1)，編碼86個氨基酸。Blastx分析結果表明，該標記序列編碼葡萄的一種假定蛋白。

2.3 RAPD標記OPS03-1354對種間雜交廣西-1x京可晶F₁代的輔助選擇

RAPD分析結果(圖2)顯示，抗病親本中國野生華東葡萄廣西－1中存在RAPD標記OPS03-1354，感病親本歐洲葡萄京可晶中不存在，在2者雜交的F₁。代339個抗病單株中，除廣京-17、廣京-19、廣京-30、廣京-56、廣京-328共5個單株中不存在這一標記外，其余334株中均存在這一標記，與田間抗性表現型的符合率為98.52％。這說明中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1354在F₁，代表現為顯性遺傳。

2.4 RAPD標記OPS03-1354對種間雜交白河－35-1x佳利釀F₂：代的輔助選擇

用特異引物OPS03對白河-35-1x佳利釀F₂代的RAPD檢測結果(表1)顯示，F₁單株6-12-1、6-12-2、6-12-4、6-12-6均表現抗黑痘病，也均存在抗病基因的RAPD標記OPS03-1354；在6-12-1自交獲得的56株雜種中，50個抗病單株中有43株存在這一標記，有7株不存在，而在其6株感病單株中也存在這一標記；在6-12-2自交獲得的61株抗病單株中，有51株存在這一標記，有10株中不存在：在6-12-4自交獲得的51株雜種中，50個抗病單株中有44株存在這一標記，在1個感病單株中不存在：在6-12-6自交獲得的39株雜種中，33個抗病單株中有31株存在這一標記，在其6個感病單株中有3株不存在。

綜上，特異引物OPS03對種間雜交白河-35-1x佳利釀F₂代207株的檢測結果表明，表現抗病的194株中有169株存在抗黑痘病基因的RAPD標記OPS03-1354，表現感病的13株中有4株不存在這一標記，檢測結果與田間抗病表現型的符合率為83.57％。在F₂代群體中，出現抗病但不存在RAPD標記OPS03-1354和感病但存在這一標記的現象，推測是由于F₁單株在自交形成配子時發生染色體交換的緣故。

3 討 論

本研究是在獲得中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1300的基礎上舊，回收、克隆了這一標記，并經測序獲得了序列全長(1 354 bp)，這為進一步將該標記轉換為SCAR標記提供了DNA分子依據。在NCBI Database通過對RAPD標記OPS03-1354進行序列比對，發現OPS03-1354序列與99條來自歐洲葡萄的EST有同源性，特別是與1條來自赤霞珠葉片感染葡萄皮爾斯病原菌(Xyellafastidiosa)后獲得的EST有較高的同源性(82％)，說明該標記序列可能是這條EST的部分序列，由此推-論該標記序列可能與葡萄抗皮爾斯病有關。該標記序列還與1條來自中國野生華東葡萄白河35-1葉片接種霜霉病病原菌(Plasmopara viticola)后獲得的EST有67％的同源性，說明該序列可能還與葡萄抗霜霉病有關。此外，該標記序列編碼葡萄的一種假定蛋白，說明該標記序列包含有外顯子。我們下一步研究的重點是分析和驗證該標記序列在葡萄皮爾斯病原菌或霜霉病病原菌誘導下的功能。

關于葡萄對黑痘病的抗性遺傳，Mortensen以美洲葡萄與感病的歐洲葡萄品種及雜種為試材研究認為，葡萄抗黑痘病受3對獨立基因所控制。王躍進等通過研究中國野生葡萄與歐洲葡萄品種雜交的親本及其F₁代抗黑痘病的表現，認為中國葡萄屬野生種在F₁代表現為極強的顯性遺傳特性。本研究從DNA分子水平上初步探索了中國野生葡萄抗黑痘病基因的遺傳表現，從抗黑痘病基因RAPD標記OPS03-1354在廣西-1x京可晶親本及其F₁代中的出現情況看，抗病親本華東葡萄廣西-1中存在這一標記，感病親本歐洲葡萄京可晶中不存在，在2者雜交獲得的F₁代339株中，98.52％的植株存在該標記，說明該標記能夠穩定地遺傳給雜種F₁代，而且表現出顯性遺傳的特征。由于該標記與抗黑痘病基因相連鎖，也即表明中國野生葡萄抗黑痘病基因表現為顯性遺傳。進一步對白河-35-1x佳利釀F₂代進行RAPD分析，抗病的華東葡萄白河-35-1中存在這一標記，感病的歐洲葡萄佳利釀中不存在，4個抗病的F₁單株分別自交獲得的F₂代207株中，86％的植株存在這一標記，即該標記在F₂代的分離大于3：1的比例，說明該標記表現出極強的顯性遺傳特征，也即中國野生葡萄抗黑痘病基因表現為極強的顯性遺傳特征。

在RAPD分析中，存在RAPD標記OPS03-1354在廣西-1×京可晶F₁代的5個抗病單株中不出現的異常現象，推測是由于染色體變異的緣故，即引物OPS03在染色體上的結合位點發生了突變，導致該引物不能擴增出這一標記片段。同樣，OPS03—1354在白河-35-1×佳利釀在F₂代的一些抗病單株中不出現，而在一些感病單株中出現，推測是由于親本在自交形成配子時發生染色體交換的緣故。染色體的變異僅發生在少數雜種單株中，即存在分子標記OPS03-1354與雜種單株表現型不符合的問題，但對于大量雜種抗黑痘病的早期選擇，RAPD標記OPS03-1354仍可用于幼苗的初步篩選，尤其是對中國野生葡萄與歐洲葡萄的種間雜種。在今后的研究中，可將該標記轉換成SCAR標記應用于輔助育種，以進一步提高早期選擇的效率，也可用于葡萄遺傳作圖研究和抗黑痘病基因的圖位克隆研究。

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