ＵＶ－Ｃ輻射對盆栽葡萄北豐葉片和鄰近果穗果實白藜蘆醇及其糖苷質量分數的影響

摘要：以1 a生北豐(Vitis thunbergii*V.uinifera)葡萄盆栽結果樹為試材，在果實始熟期采用紫外線C(Uhrayiolel C，Uv-C)輻射結合韌皮部環剝的方法，研究了UV-c輻射對葡萄葉片和鄰近果穗果實白藜蘆醇(Resveratrol.Res)及其糖苷質量分數的影響。結果表明，UV C輻射誘導葡萄果實Res合成積累的敏感性低于葉片，輻射葡萄葉片對鄰近果穗上果皮Res的影響遠遠小于UV-c直接輻射葡萄果穗，且輻射誘導葡萄果皮中Res質量分數與葉片中Res質量分數存在著一定的相關性。當葉片位于果穗下方時，葉片中反式白藜蘆醇(trarts-Rcsyeratrol，trana-Res)、反式白藜蘆醇苷(trana-Piceid，trans-PD)和順式白藜蘆醇苷(cis-Piceid，cis-PD)質量分數表現出環剝處理顯著高于不環剝處理，然而果皮中的結果正好相反。當葉片位于果穗上方時，果皮中trans-Res、trans-PD和cis-PD質量分數表現出不環剝處理顯著高于環剝處理，暗示葡萄Res可能存在韌皮部運輸途徑，且運輸方向是雙向的。此外，uv-C直接輻射葡萄果穗處理果皮trans-Res和cis-PD質量分數顯著高于對照和UV-C輻射葡萄葉片處理。種子中僅檢測到trans-Res，且僅環剝處理和輻射下方葉片不環剝處理顯著高于對照。

關鍵詞：葡萄；UV-C輻射；環剝；白藜蘆醇；白藜蘆醇苷

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2009)04-461-05

白藜蘆醇(ResveratroI，Res)是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，結構式存在反式(trans－ResveratroI，trans-Res)和順式(cis-Resveratrol，cis-Res)2種類型。研究發現，Res具有良好的防治心血管疾病的功效。Res在癌細胞的起始、增殖、發展3個主要階段均有抑制乃至逆轉作用，被譽為繼紫杉醇后的又一新的綠色抗癌藥物。Res也可以通過糖基化而形成白藜蘆醇苷(piceid，PD)，PD具有與Res相似的生物活性，且選擇性、穩定性遠大于Rest。

葡萄是栽培面積最大的果樹樹種之一。葡萄種質資源豐富，Res質量分數相對較高，被認為是人類食品中Res的最重要來源。但目前生產上大量栽培的無論是歐亞種品種還是歐美雜交種品種，自然條件下Res質量分數較低，其果皮和種子內的Res質量分數通常低于2μg·g^-1。同一葡萄植株不同器官間Res質量分數存在較大差異。且曾經有報道葡萄漿果中Res的質量分數與葉片中Res的質量分數存在著一定的相關性，是否意味著葉片中合成的Res可能向果實中運輸，或者根據葡萄漿果果肉內Res質量分數極低而種子和果皮質量分數較高而推斷出Res在葡萄植物體內不具有可運輸或移動性，而有關Res在植物體內的運輸目前尚無任何研究報道。

紫外輻射(Ultraviolet，UV)能誘導葡萄合成Res，且UV-C輻射誘導果實Res合成積累的敏感性遠低于葉片。盡管上述研究為人工UV-C輻射處理獲得高Res的葡萄和葡萄加工原料提供了可能，但是通過UV-C輻射葡萄果實的可操作性差，如果能在果實發育期通過輻射葉片來提高漿果的Res質量分數，則在生產中具有較重要的價值，這既利于生產上操作而又避免了UV-C直接輻射所造成的葡萄漿果外觀品質下降。作者通過UV-C輻射誘導葡萄葉片提高漿果Res及其糖苷質量分數的研究結果，同時初步研究了UV-C輻射誘導葡萄葉片合成的Res及其糖苷的運輸途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采用1 a生盆栽北豐(Vitis thtmbergii*V.vinfera，中國科學院植物研究所育成)結果樹(萌芽期選擇有花序的健壯結果枝高空壓條，生長期分2次剪斷盆栽部分與母體的聯系，7月中旬即可獲得1a生盆栽結果樹)。每株1個結果枝，輻射時僅保留1個果穗和10片健康葉。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料處理 在果實進入始熟期后，將整理好的盆栽葡萄結果樹移入空氣相對濕度為70％～80％、光照強度為400～800 μmol·m^-2·s^-1、溫度為22～25 ℃的人工生長室，設2個對照和5個處理(圖1)，(1)葉片上方和下方對結果枝環剝(CK-L)為對照；(2)果穗上方和下方對結果枝環剝(CK-F)，不進行UV-C輻射處理為對照；(3)葉片位于果穗上方，葉片進行UV-C輻射處理，葉片上方和果穗下方對結果枝環剝(L_up)；(4)葉片位于果穗上方，葉片進行UV-C輻射處理，葉片上方、果穗下方以及葉片和果穗之間對結果枝均進行環剝(*L_up)；(5)葉片位于果穗下方，葉片進行UV-C輻射處理，果穗上方和葉片下方對結果枝環剝(L_down)；(6)葉片位于果穗下方，對葉片進行UV-C輻射處理，果穗上方、葉片下方以及果穗和葉片之間對結果枝均進行環剝(*L_down)；(7)果穗上方和下方對結果枝環剝。果穗進行UV-C輻射處理(F_uv)，在輻射過程中每隔2.5min轉動1次果穗位置。單株小區，3次重復。

1.2.2 UV-C處理試材的方式 用裝有3支40WUV-C(254 nm)燈管(北京電光源研究所)的培養架，對葉片背面或果穗進行輻射處理，在照射過程中用錫箔紙包裹不照射的果實和葉片。調節培養架的放置距離使到達葉片或果穗的輻照光強為3 w·m-2(采用北京師范大學光電儀器廠生產的紫外輻照計測定輻射強度)，輻射時間為lO min。UV-C處理后24h，分別對葉片和果實(果皮和種子)進行取樣。液氮速凍粉碎，-40℃保存待測。

1.2.3 北豐葉片果皮和種子Res及其糖苷提取和高壓液相色譜(HPLC)分析 Res及其衍生物提取參考李曉東等的方法。準確稱取葡萄葉片(3 g)、果皮(3 g)或種子(2 g)凍樣，置于研缽中，加入少量石英砂和乙酸乙酯(種子用甲醇)并迅速研磨成勻漿，共用15 mL乙酸乙酯(種子用甲醇)分次洗至刻度試管，室溫避光浸提48 h后，10 000g離心15min，取上清液，45℃減壓濃縮至干，用1 mL甲醇溶解定容，過0.45μm微孔濾膜供HPLC分析。質量分數測定采用DionexSummit^TM HPLC系統，包括DionexP680泵、Dionex TCC-100柱溫箱、Dionex PDA-100檢測器(美國戴安公司)。色譜柱：InertsilODS-3柱(250mmLx4.6mmI.D.5μm粒徑，日本GL科技公司)和Sunchrom C₁₈保護柱(北京金歐亞科技發展有限公司)。柱溫：25℃。進樣量：10μL。流速：1.0mL·min^-1。檢測波長：306 nm和288 nm。3D掃描：200～380 nm。梯度洗脫：流動相A[乙腈(德國Sigma-Aldrich公司)]一流動相B(重蒸水)，洗脫程序為初始90％A、10％B，14 min內轉為70％A、30％B，在2rain內轉為90％A、10％B，然后平衡2 min。trans-Res標樣購于Sigma公司，trans-Piceid標樣(純度>99％)購于北京迪爾塔金公司，cis-Res和cis-Piceid由traxt8-Res和trans-Piceid經UV-C輻射轉化制備，質量分數通過反式異構體的減少量計算。

1.2.4 數據處理 Chromeleon色譜管理系統(Version 6.50)數據處理，外標法定量。最小檢出限0.011μg·g^-1。回歸方程：y=1.736x-O.157 7，r²=0.998 9(trans-Res)，y=2.956 9x+0.597 8，r²=0.999 2(cis-Res)，y=3.256 1x+0.445 4，產=0.997 9(trans-Piceid)，y=3.631 3x-0.082 9，r²0.998 3(cis-Piceid)。采用SPSS11.0 for Windows(美國SPSS公司)數據處理，Duncan氏多重比較，顯著水平為P<0.05。采用SigmaPlot10.0(美國SPSS公司)作圖。

2 結果與分析

2.1 葉片中Res及其糖苷質量分數

所有UV-C輻射處理和對照葉片(CK-L)中僅檢測到trans-Res、trans-PD和cis-PD，未檢測到cis-Res(圖2-A～C)。對葉片進行UV-C輻射處理后24 h，無論葉片位于果穗上方還是下方以及葉片和果穗之間是否進行環剝，葉片trans-Res質量分數均顯著高于對照(圖2-A)。葉片位于果穗下方時接受UV-C輻射處理(L_down和*L_down)后葉片中trans-Res質量分數高于葉片位于果穗上方的2個處理(L_up和*L_up)，且在果實與葉片間環剝時(*L_up)顯著高于不環剝(L_up)。對于葉片trans-PD質量分數(圖2-B)，僅。*L_down處理顯著高于對照，而其他處理與對照間葉片trans-PD質量分數不存在顯著差異。此外，僅僅葉片位于果穗下方時葉片接受UV-C輻射處理(L_down和*L_down)能顯著增加cis-PD質量分數，并且在果實與葉片間環剝處理的作用顯著高于不環剝(圖2-C)。

2.2 果皮中Res及其糖苷質量分數

與葉片一樣，所有UV-C輻射處理和對照果皮(CK-F)中也僅檢測到tranz-Res、trans-PD和cis—PD，未能檢測出cis-Res(圖2-D～F)。UV-C直接輻射葡萄果穗處理(F_uv)果皮中trans-Res的質量分數顯著高于對照(CK-F)和UV-C輻射葡萄葉片處理(L_up*L_up、L_down和*L_down)。對果穗進行UV-C輻射處理后24 h，F_uv處理果皮中trans-Res質量分數達到29.14μg·g^-1，為對照的29.23倍。UV-C輻射葡萄葉片處理鄰近果穗果皮中trans-Res的質量分數主要受韌皮部是否連通的影響，與葉片相對位置無關，不環剝處理(L_up與L_down)顯著高于相應環剝處理(*L_up與*L_down)和對照，而2者之間不存在顯著差異(圖2-D)。僅L_up處理果皮中trans-PD質量分數顯著高于對照，其他處理(包括F_uv)與對照間不存在顯著差異(圖2-E)。然而除*L_up處理外，所有處理果皮cis-PD質量分數均顯著高于對照(圖2-F)，且F_uv與L_down處理質量分數最高，顯著高于其他處理，不環剝處理(L_up與L_down)顯著高于環剝處理(*L_up與*L_down)。

2.3 種子中Res質量分數

種子中僅檢測到trans-Res(圖2-D～F)。F_uv處理不能夠提高種子trans-Res質量分數。除L_up。處理外的UV-C輻射葡萄葉片處理(*L_up、L_down和*L_down)的種子trans-Res質量分數顯著高于對照，且環剝處理(*L_up與*L_down)顯著高于相應不環剝處理(L_up與L_down)(圖2-D)。

3 討 論

葡萄葉片與果實對UV-C處理的敏感性差異很大。本研究結果表明UV-C輻射葡萄葉片處理，葉片trans-Res質量分數由2.79μg·g^-1增加到131.31μg-g^-1(L。處理)～237.10μg·g^-1(*L_down處理)，增長46.08～84.01倍；而UV-C直接輻射葡萄果穗處理(F_uv處理)果皮trans-Res質量分數為29.14μg·g^-1，增長28.23倍，表明UV-C輻射誘導果實Res合成積累的敏感性遠低于葉片，本研究與前人研究結果一致。

由于Res的順式異構體(cis-Res)光敏性強，極不穩定，自然界中葡萄Res僅以反式異構體(trans-Res)存在。本研究結果表明，在葡萄的葉片和果皮中僅檢測到tratks-Res，而檢測不到cis-Res，但是同時檢測到trans-PD和cis-PD。種子中僅檢測到trans-Res，未能檢測到cis-Res、trans-PD和cis-PD(圖2A-2F)，與Trela等研究結果一致。由此結果我們可以推斷，對于活體葡萄，cos-Res極不穩定，它可能被迅速轉化成trans-Res，或通過糖基化而形成cis-PD。

葡萄果皮中Res質量分數與葉片中Res質量分數存在著一定的相關性，且曾經有報道葡萄漿果中Res的質量分數與葉片中Res的質量分數存在著一定的相關性。本研究結果表明，當葉片位于果穗下方時，葉片中trans-Res、tranz-PD和cis-PD質量分數表現出在果實與葉片間環剝處理(*L_down)顯著高于不環剝處理(L_down)，然而果皮中的結果正好相反。當葉片位于果穗上方時，果皮中trans-Res、trans-PD和cis-PD質量分數表現出在果實與葉片間不環剝處理(L_up)顯著高于環剝處理(*L_up)。上述結果似乎暗示葡萄Res可能存在韌皮部運輸途徑，使得葉片中的Res及其衍生物有一小部分轉到果皮中，且運輸方向是雙向運輸，向上(頂端)運輸多于向下運輸，關于果實中的Res來源問題仍需進一步從生理生化以及分子生物學角度來研究。

UV-C輻射誘導葡萄葉片提高Res及其糖苷質量分數的同時能夠提高鄰近果穗果實果皮和種子Res及其糖苷質量分數，對于我們通過果實獲得所需Res非常有利，因為這既利于生產上操作而又避免了UV-C直接輻射所造成的葡萄漿果外觀品質下降。但單純從提高果實Res及其糖苷質量分數的角度，UV-C直接輻射葡萄果穗處理(F_uv處理)效果遠大于UV-C輻射葡萄葉片間接影響鄰近果實處理。

4 結 論

在果實始熟期通過UV-C輻射葉片可以提高漿果果皮中Res及其糖苷質量分數。Res及其糖苷存在韌皮部運輸途徑，且運輸方向是雙向的。UV-C輻射誘導果實Res合成積累的敏感性遠低于葉片，輻射葡萄葉片對鄰近果穗上果皮Res的影響遠遠小于UV-C直接輻射葡萄果穗，且輻射誘導葡萄果皮中Res質量分數與葉片中Res質量分數存在著一定的相關性。

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