杏果實發育過程中有機酸積累與相關代謝酶的關系

摘要：以新世紀杏為試材，測定了果實發育過程中有機酸質量分數及相關代謝酶一檸檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、烏頭酸酶(ACO)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活性，并對果實中有機酸積累與酶活性的關系進行了分析。結果表明，杏果實有機酸主要有蘋果酸和檸檬酸，成熟果實中蘋果酸占總酸量的95％以上，在果實發育過程中，有機酸質量分數緩慢上升，花后51 d達最大值，之后逐漸下降。相關分析表明，蘋果酸質量分數與MDH活性呈正相關，與CS活性及ACO活性呈負相關。檸檬酸質量分數與CS活性呈正相關，與MDH活性呈顯著負相關，相關系數為0.867 5*。研究認為，CS、MDH和ACO是杏果實有機酸積累的主要酶，PEPC的作用不大。

關鍵詞：杏；有機酸；有機酸代謝酶

中圖分類號：S662.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2009)04-471-04

有機酸組分及質量分數是果實品質的重要組成因素，有機酸在果實生長過程中積累，在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環等呼吸基質，以及糖原異生作用基質而被消耗。果實發育過程中有機酸質量分數的增減與相關酶系統的改變密不可分，前人相關研究表明：檸檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、烏頭酸酶(ACO)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)是影響果實有機酸代謝的重要酶。研究發現：菠蘿、臍橙和柑橘等檸檬酸型水果，在果實發育過程中，CS和PEPC的活性較高；文濤等認為CS和PEPC是影響臍橙有機酸積累的重要酶；趙永紅等對設施油桃有機酸代謝的研究發現，MDH活性變化與蘋果酸質量分數呈顯著相關，而CS與檸檬酸質量分數相關性不大。因此不同的有機酸類型果實，其有機酸代謝酶的活性有很大差異。杏果實屬于蘋果酸積累型，目前杏果實有機酸代謝相關酶的變化動態及其與有機酸積累的關系尚未見報道，我們以華北生態型的新世紀杏為試材．研究杏果實發育過程中有機酸積累及有機酸代謝相關酶活性變化，旨在探討杏果實有機酸積累的機理．明確杏有機酸積累的關鍵酶，為進一步在分子水平上研究其代謝與調控機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2007－2008年在山東農業大學園藝科學與工程學院中心實驗室和泰安橫嶺育種基地進行。試材為華北生態型的新世紀杏(Armeniaca Vul－garis Cv.Xinshiii)。盛花期為3月22-26日，選擇有代表性的植株，分別于花后30 d(幼果期)、花后37 d(膨大期)、花后44 d(硬核前期)、花后51 d(硬核期結束)、花后58 d(著色期)、花后65 d(完熟期)，進行果實取樣(每次均在果樹外圍采取果實20個)，試驗重復3次。

果實采后去皮去核，迅速放入液氮中冷凍，冷凍后放入30℃冰箱中備用。分析時分別測定果肉部分的糖和酶活性。

1.2 有機酸組分的高效毛細管電泳(CE)分析

用Beckman毛細管電泳儀進行有機酸組分分析測定，分離條件如下：緩沖溶液為100 mmol·L^-1Na₂HPO₄+0.5mmol·L^-1 CTAB+10％乙腈，pH 7，電壓12 kV，負極進樣，壓力3S進樣，溫度20℃，200 nm間接檢測。新毛細管依次用1 mol·L^-1HCL，1 mol·L^-1NaOH及重蒸水老化并沖洗40 min；2個樣品之間用背景緩沖液沖洗3 min，每隔5個樣品用0.1 mol·L^-1NaOH、重蒸水、緩沖液沖洗5 min。所有緩沖溶液、樣品液、標準樣品溶液在進樣前均經0.45μm的濾膜過濾，然后超聲脫氣。

1.3 酶的提取

取果肉2 g加2 mL研磨緩沖液(0.2 mol·L^-1Tris-HCl(pH 8.2)，0.6 mol·L^-1蔗糖，10 mol·L^-1異抗壞血酸)，冰浴下用組織研磨器研磨，4℃，4 000xg離心20 min，取上清液定容至5 mL。其中2 mL15 000xg，4℃離心15min，取上清液用緩沖液提取(緩沖液為0.2 mol·L^-1Tris-HCl(pH 8.2)，10 mol·L^-1異抗壞血酸，0.1％TritonX-100)，定容至4 mL即得細胞質烏頭酸酶液(Cyto-Aconitase)；沉淀用提取緩沖液定容至2 mL即得線粒體烏頭酸酶(Mito-Aconi—tase)。另外3 mL加等體積提取緩沖液，可用于測蘋果酸脫氫酶，取其中4 mL分為2份，在大量透析液(即提取緩沖液)中4℃透析過夜，用新鮮透析液定容即得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶酶液。

1.4 酶的活性測定

酶活性測定用Srene法，略有改動。反映體系為0.5 mL，加入反應底物后立即用UV-8500型紫外分光光度計測定吸光度．10S為單位讀數．掃描3min，記錄吸光度變化，重復3次；以1 min吸光度變化0.01為1個酶單位，酶活性以單位每克果肉每分鐘表示(U·g^-1·min^-1)。

1.5 數據處理

有機酸質量分數與代謝酶的相關性分析，采用SAS進行對應時期的動態分析；其余數據利用Excel和DPS進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 杏果實發育期過程中有機酸組分的變化

新世紀杏果實有機酸的組分變化見圖1。杏果實中主要是蘋果酸和檸檬酸，在果實發育的過程中，蘋果酸在較高水平上緩慢增加，花后51 d達最高值，質量分數為45.82 mg·g^-1；隨著果實成熟，質量分數逐漸下降。檸檬酸的質量分數較低，在杏果實發育過程中，質量分數變化較小。果實成熟時，蘋果酸占總酸量的95％62。

2.2 杏果實中有機酸代謝相關酶活性的變化

2.2.1 鳥頭酸代謝酶(ACO) ACO主要分為線粒體和細胞質2種同工酶。線粒體ACO主要參與TCA循環；細胞質ACO則在多種生化過程中發揮作用。新世紀杏果實發育過程中ACO活性的變化見圖2。線粒體ACO在果實發育前期活性較低，在硬核期結束后(花后51 d)，果實進入成熟期，活性迅速上升，至果實成熟時，酶活性達到最高值90 u·g^-1·min^-1；而細胞質ACO活性前期較高，果實進入硬核期．酶活性迅速下降到較低水平，隨著果實成熟，酶活性又逐漸升高，到著色期(花后58 d)升高到25.3 u·g^-1min^-1，成熟時略微下降。

2.2.2檸檬酸合成酶(CS) 由圖3可以看出．CS活性在果實發育的前期和后期活性較高，中間活性較低，果實成熟時，酶活性達最大值16.53 u·g^-1·min^-1。酶活性的變化趨勢與檸檬酸質量分數的變化較平穩趨勢并不吻合。

2.2.3 蘋果酸脫氫酶(MDH) MDH活性的變化見圖4。由圖中可以看出，MDH的活性較高，其變化呈先下降后上升的趨勢，在著色期(花后58 d)，活性降到最低，隨著果實的成熟，酶活性略有上升。

2.2.4 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) 由圖4可以看出，在果實發育過程中，PEPC活性較低，變化較為平穩，呈現大“M”形變化，在花后37 d和58 d呈現2次高峰，酶活性分別為：59.89U·g^-1·min^-1。和73.57 u·g^-1·min^-1。

2.3 杏果實中有機酸積累與代謝相關酶活性的關系

新世紀杏果實有機酸積累與代謝相關酶的關系見表1。CS活性與檸檬酸呈正相關，與蘋果酸呈負相關；線粒體ACO和細胞質ACO活性與蘋果酸呈負相關，相關系數分別為-0.636 2和-0.778 2：MDH活性與蘋果酸呈正相關，與檸檬酸變化呈顯著負相關，相關系數-0.867 5*；PEPC活性與蘋果酸及檸檬酸的相關系數很低。結果表明，CS、MDH和ACO是杏果實有機酸積累的主要酶，而PEPC的作用不大。

3 討 論

有機酸是果實品質的一個重要部分．與糖一起形成果實的風味。不同類型果實有機酸組成及其變化不同，通常果實成熟時酸度會降低。杏屬于蘋果酸型果實，以蘋果酸為主，檸檬酸的質量分數很低。本試驗中發現：在果實發育過程中，MDH代謝旺盛，其活性與蘋果酸質量分數呈正相關；而與檸檬酸質量分數呈顯著負相關，相關系數為-0.867 5*。由此推測，杏果實中高的MDH活性是造成蘋果酸質量分數高、檸檬酸質量分數低的主要原因。對臍橙、柑橘等檸檬酸型果實的研究發現，PEPC和CS活性高，與檸檬酸積累成顯著正相關。因此果實有機酸類型不同．其代謝的主要酶活性存在很大差異。

研究表明，ACO的活性與檸檬酸的積累有一定的關系，但由于酶活性太低，所以相關性不大。羅安才等研究認為，柑橘果實發育后期細胞質ACO活性的上升造成柑橘果實中有機酸分解加快，積累減少。本研究也發現，線粒體ACO和細胞質ACO活性與蘋果酸質量分數呈負相關，說明杏果實發育后期蘋果酸質量分數的下降與ACO活性上升關系密切。

果實有機酸的代謝與調控是一個復雜的生理過程，檸檬酸與蘋果酸都是三羧酸循環(TCA)的中間產物．其合成與降解均與TCA循環密切相關。在植物細胞中，PEPC只存在于細胞溶質中，催化丙酮酸與CO₂：形成草酰乙酸，可供進一步合成檸檬酸，是CO₂暗固定的關鍵酶。Haffaker等提出果實中檸檬酸的合成途徑是：草酰乙酸(OAA)在CS的催化下與乙酰輔酶A(Ac-CoA)結合生成檸檬酸。本試驗中，CS活性與檸檬酸質量分數呈正相關，在整個果實發育過程中，CS活性較低，可能也導致果實檸檬酸的積累較少。而PEPc與有機酸質量分數相關性較小，在果實有機酸積累的作用較小。

杏果實有機酸主要有蘋果酸和檸檬酸，成熟果實中蘋果酸占總酸量的95％以上，在果實發育過程中，有機酸質量分數緩慢上升，在果實成熟階段質量分數逐漸下降。相關分析表明：蘋果酸質量分數與MDH活性呈正相關，與CS活性及ACO活性呈負相關。檸檬酸質量分數與CS活性呈正相關，與MDH活性呈顯著負相關，相關系數為-0.867 5*。研究認為．CS、MDH和ACO是杏果實有機酸積累的主要酶，PEPC的作用不大。

果實有機酸代謝是一個復雜的過程，是各種酶綜合調控的結果，受外界環境影響較大。杏果實有機酸代謝、調控機制有待于在分子水平上進一步研究。

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