果梅（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）品種的熒光ＡＦＬＰ指紋分析

摘要：熒光AFLP以其操作簡易、靈敏性高、可半自動化操作、可軟件輔助分析等特點在果樹品種鑒定以及遺傳資源分析中具有明顯的優越性。對熒光AFLP用于果梅品種鑒定進行了研究。所利用的8對選擇性引物都可以獲得清晰的AFLP指紋，并且任何一對引物都能夠很好的區分這50個品種，表明了該技術適于快速鑒定大量果梅品種或用于種質資源的遺傳分析。同時，研究利用AFLP指紋信息對來源我國江蘇、浙江、廣東、福建、云南、四川、湖南7個省份以及日本的果梅品種的遺傳多樣性指數進行了分析，結果表明，日本(O.245 1)，中國江蘇、浙江(O.191 2)果梅的遺傳多樣性水平明顯高于其他幾個省份，可能由于這2個地區果梅品種的來源渠道多或者存在其他物種的基因滲入。

關鍵詞：果梅；熒光AFLP；遺傳變異

中圖分類號：S662.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2009)04-475-06

DNA是生命體的遺傳物質，任何性狀的形成根本上都是基因控制的。具體地說，基因的表達、表達產物蛋白的有無以及性狀的類型等都是遺傳物質DNA決定的。這也決定了DNA信息用于果樹分類的優勢所在。DNA分子標記的發展為果樹分類提供了重要的技術體系。常用的DNA標記技術有RAPD(Rapid Amplified Polymorphic DNA)，RFLP(Re-stricted Fragment Length of Polymorphism)、SSR(Simple Sequence Repeats)、AFLP (Amplified Frag-ment Length P0lymorphism)以及SNPs (Sinde Nu-cleotide P0lymorphism)。這些技術各有優勢，對于果梅品種分類都具有很好的適用性。Shimada等與Ozaki等先后利用RAPD技術對果梅進行了品種鑒定和分類，結果發現梅品種基因組DNA表現出豐富的多態性，而且某些品種有穩定遺傳的特異帶。張俊衛等對梅、桃、李、杏、櫻桃進行了RAPD分析表明RAPD在鑒定物種及物種間親緣關系中的具有很好的可行性。Gao等利用SSR標記進行果梅品種鑒別的研究。Fang等成功嘗試了AFLP技術用于果梅品種鑒定的研究。其中，AFLP在技術穩定性、不需預知DNA序列信息、檢測信息無限、易操作、可檢測品種數量多等方面的特點使其在果樹大量品種鑒別以及遺傳資源分析方面具有更明顯的優勢。迄今，AFLP技術中指紋的顯示主要采用銀染、同位素標記以及熒光標記等，而后者在操作簡易、高靈敏性、實驗條件穩定、可半自動化、可儀器輔助指紋分析等方面的特點是很多DNA標記技術無法實現的。

梅(Prunus mume Sieb.et Zucc)在我國已有超過7 000 a的應用歷史，其中果梅是我國特色果樹之一。我國果梅種質資源豐富，僅記載的就有190多個品種與優株(不包括國外引進品種)，另外還有大量的野生果梅資源。開展DNA分子標記在果梅上的研究對于果梅品種鑒定、品種系譜分析、遺傳圖譜構建以及重要園藝性狀標記具有重要的意義。為此，我們首先開展了果梅熒光AFLP指紋的研究，為果梅遺傳資源的大量研究、基因標記研究、遺傳圖譜構建等提供了新的技術體系與研究經驗。

1 材料和方法

1.1 植物材料

50個果梅品種幼葉取自南京農業大學果梅種質資源圃(表1)。其品種信息可參考中國果樹志一果梅卷，原產地分別為中國的江蘇、浙江、廣東、福建、云南、四川和湖南以及日本。

1.2 DNA提取

基因組DNA的提取方法為改良CTAB法。

1.3 熒光AFLP分析

本研究所采用的技術路線參考Fang等所介紹。DNA使用Hoefer DyNA Quant 200熒光計進行定量化后，利用Gibco-BRL公司生產的AFLP試劑盒(AFLP Analysis System I)進行AFLP分析。

提取后的DNA(150μg)利用1μL的EcoR I/Mse I酶(1.25 μnits·μL^-1)在37℃條件下酶切6 h，然后使用1.5 μL(1 μnits·μL^-1)的T4 DNA連接酶連接EcoRIIMse I接頭(表2)，25℃條件下連接3h。酶切一連接后的DNA產物用ddH₂O進行稀釋10倍。

PCR預擴增反應(所用引物序列見表2)在42μL反應體系中進行，稀釋的酶切一連接DNA產物5.0μL，Pre-amp mix I 28.3 μL，10xPCR btxffer 4.2 μL，MgCl₂(2.5 mmol·L^-1)4.2 μL和Taq DNA polymerase(5μnits·μL^-1)(Promega，Wisc，USA)0.3μL，預擴增程序為：94℃30 s，56℃1 min，72℃1 min，30個循環，72℃10 min，1個循環。將預擴增PCR產物用ddH₂O按1：35稀釋后用于隨后的選擇性PCR擴增。選擇性擴增使用2 μL的預擴增產物DNA.Mse Iprimer(序列如表2)(8.3 μmol·L^{-1)1.2 μL，IRD700-labeled EcoR I primer(1 μmol·L-1)O.6 μL，lOxPCR btxffer 1.2 μL，MgCl₂(2.5 mmol·L-1)1.2 μL，ddH₂O 5.1 μL，和Taq DNA polymerase(5 μnits·μL-1)0.1 μL。選擇性擴增程序為：94 ℃ 30 s，63℃(每循環降低1℃)30 s，72℃1 min，10個循環后，94℃30 s，56℃30 s，72 ℃ 1 min，28個循環，72℃延伸，10 min。}

熒光標記的選擇性擴增產物在25 cm×0.25 cm，8.O％變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。電泳系統為LI-COR 4000-L自動測序儀(LI-COR Ine，Lincoln，NE，USA)。在加樣前，需要進行預電泳，預電泳條件為1 500 V，40 mA，40 W，電泳時間為30～50 min(凝膠溫度50 ℃)。擴增后的PCR樣品在95 ℃下變性3 min，然后立即置于冰上冷卻3～5 min。將已變性處理的樣品進行電泳，電泳條件為1 500V、50℃，時間長度3.5 h。電泳結束后指紋信息是利用Saga AFLP自動分析軟件(LI-COR Inc，USA)輔助閱讀。

1.4 數據分析和處理

AFLP譜帶得到的0，1矩陣(有帶記為1，無帶記為O)利用POPGENE Version 1.32進行遺傳多樣性和遺傳相似性分析。遺傳相似性、遺傳距離和遺傳多樣性的分析參照苑兆和等和陳省平等的報道。

參數計算(1)多態帶數A(the number of poly-morphic bands)和多態帶百分比P(the percentage ofpolymorphic bands)，多態帶百分比(％)=擴增多態性帶數／總擴增帶數×100=(N_i+N_j－2N_ij)／(N_i+N_j－N_ij)；式中，N_ij“表示樣本i和j的公共帶數，N_i、N_j分別是樣本i、j的帶數；(2)Nei’s基因多樣度指數H(Nei’s gene diversity)；(3)相似系數和遺傳距離：采用Nei等㈣的遺傳相似系數(genetic similarity，GS)，其計算公式為GS=2N_ij/(N_i+N_j)，式中N_ij，N_i，N_j同上；遺傳距離D=l-GS。

2 結果與分析

2.1 熒光AFLP指紋特征

研究共利用了8對AFLP引物組合進行果梅品種的鑒別。每對引物都產生了清晰的AFLP指紋，并且能夠用于區分50個品種。其中，引物組合E-GG+M-CTT形成的AFLP譜帶效果如圖1所示。對大小為50～600 bp范圍的清晰譜帶進行了統計分析，共檢測到804個標記，其中多態性標記552個，多態性位點的百分率為68.91％；每對引物組合產生多態性標記數目不等，最少的是E-GG+M-CAA檢測到51條多態性譜帶，最多的是E-GG+M-CTI，檢測到88條，平均每對引物擴增出69個多態性標記。不同引物產生多態性位點的百分率在62.2％～77.61％(表3)。

2.2 不同地區果梅品種遺傳相似性、遺傳距離和遺傳多樣性

從不同地理區域來源的果梅品種的遺傳多樣度的分析結果(表4)來看，4個地區果梅品種遺傳多樣性大小為日本(O.245 1)、中國江蘇、浙江(O.191 2)、中國云南、四川、湖南(O，135 5)、中國廣東、福建(0.130 6)。其中，中國廣東、福建果梅遺傳多樣性最低，可能是由于樣品的取樣數較少的原因。日本果梅遺傳多樣性最高，可能是因為其引種歷史長、引種來源廣以及其他物種基因漂移等因素所造成。

4個地區果梅品種種間遺傳相似度的分析結果(表5)表明，我國果梅品種種群間的遺傳相似度都較高，與日本果梅的遺傳差異更為明顯。在我國，云南、四川、湖南果梅和廣東、福建果梅之間遺傳相似度最高(O.985 4)，說明中國云南、四川、湖南果梅和廣東、福建果梅群體的遺傳關系很近。中國廣東、福建果梅和日本果梅之間為最低(0.944 7)(表5)。總狹窄，不利于育種親本的選擇。相比較而言，在育種實踐中，選用我國與日本的品種作為育種親本為佳。根據本研究的結果，有必要開展果梅野生資源的收集與整理以及其他核果類果樹用于果梅種質創新的研究。

3 討 論

AFLP分子標記由于具有覆蓋面廣、高保真性、高效性、高分辨率、所需DNA量少、事先毋需知道序列的任何信息、可在全基因組產生標記、其標記的分離遵循孟德爾遺傳規律、在一張電泳圖中就能把所有品種的信息都顯示出來等優點，已被廣泛用于圖譜構建及基因定位、農作物重要性狀分子標記篩選、遺傳多樣性分析、雜種純度鑒定等方面。因此，在果樹上建立與優化AFLP標記的技術體系同樣具有很大的必要性與重要性，有助于促進果樹種質資源的評價、遺傳圖譜構建以及重要性狀的標記等。熒光AFLP是用熒光染料代替放射性同位素來標記引物，從而得到熒光染料標記的片段，并用自動化測序儀進行片段的檢測，該方法較傳統方法可獲得更多的信息，是AFLP技術的一大進步。現已見應用于動植物和微生物等的遺傳變異、分子病理學及標記圖譜等的研究。Dresler-Nurmi等結合全自動毛細管電泳與銀染方法的AFLP技術對栓菌屬的片段多態性的檢測結果進行比較，結果表明這2種方法相似。Lindstedt等應用結合毛細管電泳技術對91個彎曲菌屬空腸亞種菌系進行了AFLP指紋多態性分析，并與脈沖電泳以及PCR-RFLP技術作了比較，結果表明，熒光AFLP方法具有更高的分辨率。熒光AFLP和銀染AFLP技術相比，該方法更為快速準確、易于操作且易標準化。相對于放射性同位素而言，熒光染料無污染與更安全，方便了實驗的操作。

果梅是我國的特色果樹樹種之一，我國在果梅種質資源的收集、整理與研究方面處于世界先進水平。在分子水平上開展果梅遺傳資源的評價對于果梅種質資源的研究與利用具有一定的理論指導意義。分子標記技術的利用對于果梅分子遺傳研究以及重要園藝性狀的標記同樣具有很大的促進作用。為此，我們首先對低污染與易操作的熒光AFLP技術在果梅的利用以及指紋特點進行了研究。選用的8對選擇性引物在50個品種中都擴增出清晰的指紋，共擴增出片段大小為50～600 bp的譜帶804條。熒光AFLP標記表現出豐富多態性和較高靈敏度，每對引物都可以很好地區分出50個果梅品種，是果梅品種鑒定的理想標記技術。不同引物擴增的譜帶數量以及多態性存在一定的差異，它們的變化范圍為67～133條和51％～88％，平均每對引物擴增出100.5條條帶和69條多態帶。其中，引物E－AA+M－CTA擴增出的譜帶數量最多，為133條，E－GG+M－CTT擴增出來的多態帶最多，為88條。因此，在利用AFLP標記時，篩選不同的引物組合對于提高研究的效果具有重要幫助。

從不同地域果梅品種的遺傳差異的研究結果發現，日本果梅的遺傳多樣性最高，且與我國果梅品種群間的差異也較大。可能是因為其引種歷史長、引種來源廣以及其它物種基因漂移等因素所致。在我國云南、四川、湖南果梅和廣東、福建果梅之間遺傳相似度最高，說明中國云南、四川、湖南果梅和廣東、福建果梅群體的遺傳關系很近。總體上，果梅品種遺傳相似度都較高，遺傳資源狹窄。因此，有必要開展果梅野生資源的收集與利用，改變果梅遺傳資源狹窄的現狀，豐富果梅育種親本材料的基因型。

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