梨輪紋病菌培養(yǎng)特性研究

摘 要：研究了梨輪紋病原菌的培養(yǎng)特性，結(jié)果表明，不同病原菌菌株間的致病力、菌絲日生長速率及產(chǎn)孢能力均不同，生長速率最大的菌株為P－16，生長速率最小的菌株為P－10，差異較大。菌株P(guān)-16致病力最強，菌株P(guān)－10致病力最弱。菌株P(guān)－7、P－13、P-16產(chǎn)孢量較大，P－4、P－10、P－19無分生孢子器產(chǎn)生；病原菌菌絲最佳生長溫度為28℃，最佳產(chǎn)孢溫度為25℃，分生孢子最佳萌發(fā)溫度28℃；在日光燈、黑光燈條件下有利于病原菌菌絲生長，黑暗條件下病原菌生長較慢；病原菌產(chǎn)孢在黑光燈條件下最好；不同光照條件對病原菌分生孢子萌發(fā)影響不大；病原菌菌絲生長最適pH值為7～9，產(chǎn)孢最適pH值為6～8，分生孢子萌發(fā)最適pH值為7～9；病原菌菌絲致死溫度為62℃(10 min)或57 ℃(15 min)，分生孢子致死溫度為60℃(10 min)或55℃(15 min)。

關(guān)鍵詞：梨；輪紋病；培養(yǎng)特性

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2009)04-520－05

梨輪紋病又名粗皮病、瘤皮病、水爛。是梨樹上的重要病害之一，在我國南北方梨產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，危害嚴重，以危害枝干、果實為主，也可危害葉片。該菌危害果實時，形成輪紋狀爛果，每年可造成減產(chǎn)約25％，嚴重時爛果率超過80％。輪紋病病原菌寄主范圍廣泛，除梨外，還主要危害蘋果、桃、杏、花紅、山楂、棗等多種果樹，關(guān)于果實輪紋病在國外也有少數(shù)相關(guān)報道。輪紋病菌的有性態(tài)為貝倫格葡萄座腔菌梨生專化型Botryosphaeria berengeriana de No-taris f.sp.piricola(Nose)Koganezawa et.Sakuma。屬子囊菌亞門葡萄座腔菌屬。自然界常見的無性態(tài)為輪紋大莖點菌Marophoma kawatsukai Hara，屬半知菌亞門腔孢綱，球殼孢目，球殼孢科。目前對梨輪紋病菌培養(yǎng)特性的研究很少，我們從梨輪紋病原菌的致病性、菌絲生長特性、產(chǎn)孢、分生孢子萌發(fā)等方面進行了系統(tǒng)的研究，研究結(jié)果將為綜合防治梨輪紋病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：2008年3月從南京江浦梨園和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨園收集的不同梨樹品種上的梨輪紋病枝條，經(jīng)組織分離、單孢純化、依據(jù)柯赫氏法則回接到梨果實上產(chǎn)生典型病斑后培養(yǎng)并保存。選取20個菌株，編號P-1～P-20 (P-1～P-10：江浦梨園，P－11～P-20：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨園)。

供試梨品種為七月酥，于7月中下旬采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所梨園，均已成熟。培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基。

1.2 病原菌菌絲生長速率、產(chǎn)孢量及致病力測定

梨輪紋病原菌在PSA平板上用打孔器(d=8mm)在菌落邊緣打孔并重新移植到新鮮的PSA平板上，每處理重復(fù)3次，置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日測量菌落直徑；待菌絲長滿平板后2～3 d刷去菌絲，每處理3次重復(fù)，放置于25。C、黑光燈下培養(yǎng)，20 d后以培養(yǎng)皿為單位測量產(chǎn)孢量；選用新鮮健康梨果實品種七月酥，對梨表面消毒處理，打孔并接種輪紋病菌菌絲塊，每處理3次重復(fù)，接種5 d后測量病斑直徑，取平均值。

1.3 不同溫度條件對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)的影響

將菌絲塊移植于新鮮的PSA平板上，分別置于5℃、10℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，逐日測量菌落直徑：將已刷菌絲的病原菌平板置于上述溫度梯度下，黑光燈照射，每處理3次重復(fù)，于25℃條件下20 d后測量產(chǎn)孢量；黑光燈下產(chǎn)孢培養(yǎng)20 d后，取下分生孢子器并壓碎，過濾，加無菌水制成孢子懸浮液，濃度為在10×10倍顯微鏡下分生孢子50個左右，采用凹玻片懸滴法使孢子始終處于自由水狀態(tài)，置于上述溫度梯度下培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，20 h后調(diào)查分生孢子萌發(fā)率。

1.4 不同光照條件對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)的影響

將菌絲塊移植于新鮮的PSA平板上，設(shè)12 h日光燈交替照射、日光燈24h持續(xù)照射、連續(xù)黑暗、黑光燈12 h交替照射、黑光燈24 h持續(xù)照射5個處理，每處理3次重復(fù)，于25℃下培養(yǎng)，逐日測量菌落直徑；將已刷菌絲的病原菌平板置于上述光照條件下，每處理3次重復(fù)，于25℃條件下20 d后測量產(chǎn)孢量；將孢子懸浮液置于日光燈、黑光燈和黑暗條件下，每處理重復(fù)3次，25℃條件下20 h后調(diào)查分生孢子萌發(fā)率。

1.5 不同pH值對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)的影響

將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5、6、7、8、9、1O、11、12、13，然后分別接菌絲塊于PSA平板上，每處理3次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，逐日測量菌落直徑；將已刷菌絲的病原菌平板置于25℃、黑光燈下培養(yǎng)，20 d后測量產(chǎn)孢量；將孢子懸浮液的pH值分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，置于25℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，20 h后調(diào)查分生孢子萌發(fā)率。

1.6 病原菌菌絲與分生孢子致死溫度測定

取菌絲片裝于滅菌試管中，每試管放10枚菌片，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的恒溫水浴鍋中分別處理10 min、15 min。隨機從每個試管中取出5枚菌片置于PSA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)2 d后，再以菌絲能夠生長的最高溫度為基礎(chǔ)，增加2℃設(shè)為1個處理，處理中又設(shè)1O、15 min 2個時間處理，最后確定病原菌致死溫度及相應(yīng)時間；將分生孢子懸浮液裝于滅菌試管中，采用上述相同溫度和時間處理，玻片萌發(fā)法，25℃下培養(yǎng)24 h后觀察分生孢子萌發(fā)狀況，再以孢子能夠萌發(fā)的最高溫度為基礎(chǔ)，增加2℃為1個處理，處理中設(shè)10、15min 2個時間處理，確定病菌致死溫度及時間。每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生長速率、產(chǎn)孢量及致病力測定

不同菌株在PSA平板上5 d的日平均生長速率、產(chǎn)孢量及致病力不同(表1)。生長速率最大的菌株為P-16，日平均生長速率為16.4 mm·d^-1，生長速率最小的菌株為P-10，日平均生長速率為14.5 mm·d^-1，差異較大；菌株P(guān)-16致病力最強，5d后病斑直徑達到51.5 mm，菌株P(guān)-10致病力最弱，5d后病斑直徑僅為14.5 mm；菌株P(guān)-7、P-13、P-16產(chǎn)孢量較大，P-4、P-10、P-19無分生孢子器產(chǎn)生(表1)。

2.2 不同溫度對菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)的影響

溫度對病原菌菌絲生長具有明顯的影響(圖1)。溫度在5℃和35℃寸病原菌仍有活力，低于20℃或高于30℃對菌絲生長都有抑制作用，菌絲在20 ℃～30 ℃生長良好，最佳生長溫度為28℃；病原菌在20℃～30℃均有分生孢子器產(chǎn)生，25℃時產(chǎn)孢量最大，在溫度低于10℃和或高于35 ℃時病原菌幾乎不產(chǎn)孢，溫度為20 ℃或達到30℃時雖有分生孢子器產(chǎn)生，但多不成熟，內(nèi)產(chǎn)生分生孢子少；病原菌分生孢子在溫度10℃～35℃均可萌發(fā)，在20℃～28℃萌發(fā)較好，28℃最佳，溫度為5℃時孢子不萌發(fā)，高于30℃時分生孢子萌發(fā)率顯著降低(圖2)。在溫度20℃～28℃4 h時孢子就已開始萌發(fā)。

2.3 不同光照條件對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)的影響

病原菌菌絲在日光燈12 h交替、日光燈24 h、黑光燈12h交替和黑光燈24 h條件下的日平均生長直徑分別為16.08，16.2，16.12，16.00 mm·d^-1，差異不顯著，均已達16 mm·d^-1，而在黑暗條件下菌絲的日平均生長直徑僅為14.8 mm·d^-1表明光照條件可促進菌絲生長，但菌絲生長對光源及時間的要求不嚴格(圖3)；不同光照條件對病原菌產(chǎn)孢影響較大，黑光燈最好，有明顯的分生孢子器產(chǎn)生，分生孢子器較大且均已成熟，黑光燈照射12 h和24 h 2個時間處理對分生孢子器形成的影響無明顯差異，日光燈24 h和12 h交替照射均能產(chǎn)孢，但產(chǎn)生的分生孢子器小而細散，成熟度低；黑暗條件下，刷去菌絲的平板可逐漸長出菌絲，但無分生孢子器產(chǎn)生：在日光燈、黑光燈及黑暗條件下，分生孢子萌發(fā)率差異不明顯，表明光照條件對病原菌分生孢子的萌發(fā)影響不大(圖4)。

2.4 不同pH值對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)的影響

病原菌菌絲生長所能適應(yīng)的pH值范圍較廣，菌絲在pH 5～12范圍內(nèi)均能正常生長，pH為13時菌絲不能生長，在pH7～9范圍內(nèi)菌絲生長最好，菌絲日平均生長直徑均達到了16 mm.d^-1，pH值小于6或大于lO時生長速率下降(圖5)；病原菌在pH5～12均能產(chǎn)生分生孢子器，在pH 6～8產(chǎn)孢最好；病原菌分生孢子在pH4～12均可萌發(fā)，最適pH值為7～9，pH小于5或大于10時孢子的萌發(fā)率明顯下降，pH 13時萌發(fā)率為O(圖6)。

2.5 病原菌菌絲與分生孢子致死溫度測定

病原菌菌絲的致死溫度為62℃(10 min)和57℃(15 min)；病原菌分生孢子的致死(24 h后觀察)溫度為60℃(10 min)和55℃(15 min)(表2)。

雖然不同病原菌間日平均生長速率、產(chǎn)孢能力及致病性不同，但從總體上看3者之間有一定的正相關(guān)性，如菌株P(guān)-16、P-17、P-2日平均生長直徑和病斑直徑都較大，且產(chǎn)孢較好；菌株P(guān)-10、P-11、p-12的日平均生長直徑和病斑直徑都較小，產(chǎn)孢量也較少，其中菌株P(guān)-10不產(chǎn)孢。但也有個別情況，菌株P(guān)-1、P-14的日平均生長直徑較大，但是病斑直徑及產(chǎn)孢量都較少，菌株P(guān)-7、P-13的日平均生長直徑和病斑直徑都較小但是產(chǎn)孢量卻很大，這可能與菌株的遺傳變異有關(guān)，具體原因需要進一步試驗驗證。我們在試驗中還觀察了病原菌菌落顏色和厚度，發(fā)現(xiàn)菌落顏色和厚度與菌落的生長速率、產(chǎn)孢能力及致病性并無直接的相關(guān)性。此外，在多次重復(fù)實驗中還發(fā)現(xiàn)，在黑光燈誘導(dǎo)下，待病原菌長滿平板后2～3 d時刷去菌絲進行產(chǎn)孢最佳，原因分析為：在長滿平板后2～3 d時菌絲已吸收了培養(yǎng)基大部分養(yǎng)分，這時刷去菌絲抑制了菌絲營養(yǎng)生長從而更有利于其生殖生長，很好的刺激了分生孢子器的形成。從而大量產(chǎn)出。

王金友等曾報道梨輪紋病原菌分生孢子萌發(fā)最適溫度為28℃，其次為25℃和30℃，但本實驗結(jié)果表明25℃為該病菌分生孢子萌發(fā)最佳溫度。這可能與實驗所選菌株及實驗具體環(huán)境有關(guān)。此外。陳功友報道蘋果輪紋病在12 h光照和12 h黑暗交替條件下只能形成分生孢子器，與本實梨輪紋病原菌分生孢子在此條件下會有少量分生孢子產(chǎn)出不同。這可能與輪紋病原菌寄主不同有關(guān)。

另外，在輪紋病的防治方面，國內(nèi)外的焦點已經(jīng)從化學(xué)防治逐步轉(zhuǎn)向生物防治，如木霉菌，具有溶菌及誘導(dǎo)抗性等作用，強烈抑制菌絲生長；哈茨木霉菌懸液，可有效控制蘋果輪紋病菌及導(dǎo)致輪紋狀果實病害的真菌。

輪紋病的室內(nèi)殺菌劑毒力測定以及田間接菌條件下藥效試驗需要大量病原孢子，自然菌源不足，本研究可為室內(nèi)培養(yǎng)繁殖輪紋病菌提供良好的依據(jù)，從而更好的進行室內(nèi)殺菌劑的研究和治病測定以及制定田間試驗處理方案。因此，梨輪紋病原菌培養(yǎng)特性的研究對防治田間輪紋病有著重要的理論和實踐意義。