西瓜抗病毒ＲＮＡｉ植物表達(dá)載體的構(gòu)建

摘 要：為了研究轉(zhuǎn)化同一種病毒的不同基因在轉(zhuǎn)基因西瓜中引發(fā)RNA沉默的效果以及利用RNA沉默培育抗多種病毒的策略，以pFGC5941為骨架質(zhì)粒，分別構(gòu)建了ZYMV cp、nib和Hc-Pro基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體pFIRzYMVCP、pFIRZYMVNIb和pFIRZYMVHc-Pro；利用重疊延伸PCR的方法，首先構(gòu)建了含有CMV cp、WMV cp和ZYMV cp部分基因片段的CWZ cp三價(jià)基因，采用該三價(jià)基因構(gòu)建了cWZ cp基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體pFIRCWZCP。研究首次在國(guó)際上構(gòu)建了西瓜轉(zhuǎn)基因抗病毒RNAi植物表達(dá)載體，為探討RNA沉默在轉(zhuǎn)基因抗病毒西瓜中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：西瓜；病毒病；RNA沉默；植物表達(dá)載體

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2009)04-525-07

小西葫蘆黃化葉病毒(Zucchini yellow mosaicvirus，ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaicvirus，WMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和番木瓜斑駁病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)等的大發(fā)生嚴(yán)重制約了西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤以ZYMV、WMV和CMV發(fā)生最為普遍和嚴(yán)重，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)上缺乏有效的防治措施，因此有效地控制西瓜病毒病的發(fā)生與危害是西瓜持續(xù)生產(chǎn)發(fā)展的保障，利用抗病品種是最為可行的途徑，通過轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制抗病毒新種質(zhì)可以克服傳統(tǒng)育種所遇到的障礙。RNA沉默技術(shù)已被證實(shí)是植物抗病毒的一種新策略。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene si-1encing，PTGS)也稱為RNA干擾或RNA沉默，是轉(zhuǎn)錄后mRNA產(chǎn)生的特異序列降解的機(jī)制。PTGS最初是Napoli等在矮牽牛上發(fā)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)同時(shí)受到抑制。利用含有大麥黃矮病毒(Barleyf20W dwarf virlus，BY-DV)PAV株系的復(fù)制酶基因片段構(gòu)建成可產(chǎn)生發(fā)夾式RNA結(jié)構(gòu)的載體，并將該載體導(dǎo)入大麥得到強(qiáng)抗性植株且可穩(wěn)定遺傳。Kai等證實(shí)包含TMV部分eDNA序列的反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV具有很好的抗性。最近，Kamachi等將黃瓜綠駁斑點(diǎn)病毒的外殼蛋白基因的ihpRNA載體導(dǎo)入煙草，誘導(dǎo)RNAi的產(chǎn)生，使煙草獲得了對(duì)該病毒的抗病毒性，證實(shí)煙草抗黃瓜綠駁斑點(diǎn)病毒是通過RNA沉默引起的，并且這種抗性是很高效的，為進(jìn)一步獲得抗CGMMV的黃瓜或西瓜奠定基礎(chǔ)。基于這些研究，我們?cè)谖鞴仙涎芯縍NAi介導(dǎo)的抗病毒效果，以期通過轉(zhuǎn)基因培育抗病毒西瓜新種質(zhì)。

為了分析同種病毒的不同基因與RNAi介導(dǎo)的基因沉默是否有關(guān)，評(píng)價(jià)不同基因?qū)τ谖鞴峡共《静〉男Ч瑯?gòu)建了ZYMV外殼蛋白基因cp(coat pro－tein)、ZYMV復(fù)制酶基因nib和ZYMV Uc-Pro蛋白酶基因(helper component-proteinase，HC-Pro)的反向重復(fù)表達(dá)載體，以期分析這些基因在轉(zhuǎn)基因西瓜中引發(fā)的RNA沉默效果，為進(jìn)一步培育抗病毒西瓜新種質(zhì)提供理論依據(jù)。我們?yōu)榕嘤苟喾N病毒病的轉(zhuǎn)基因西瓜新品系，重組了分別含有CMV、WMV和ZYMV cp保守區(qū)域的三價(jià)CMZ cp基因，構(gòu)建了CMZ cp基因的反向重復(fù)表達(dá)載體pFIRCWZ CP，期望分析轉(zhuǎn)3種病毒CMZ cp基因的西瓜植株對(duì)于3種病毒的抗病毒效果，為培育具有抗多種病毒的西瓜新品系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物表達(dá)載體pFGC5941為骨架質(zhì)粒，由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，章魚堿合成酶基因的終止子(OCS 3′)，目標(biāo)基因正反向片段插入位點(diǎn)之間由長(zhǎng)約1.4 kb的矮牽牛查爾酮合酶A基因內(nèi)含子(CHSA intron)隔開。pZYMV CP、pZYMV NIB和pZYMV Hc-Pro的質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室所有：DH5a為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株；各種限制性內(nèi)切酶購自MBI公司；TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自TAKARA公司；引物在英駿公司合成。

1.2 構(gòu)建ZYMVCP、nib和Hc-Pro基因片段的植物表達(dá)載體引物

采用本實(shí)驗(yàn)室保存的ZYMV外殼蛋白基因cp(登錄號(hào)：AY611025)、復(fù)制酶基因nib(登錄號(hào)：AY611023)和Hc-Pro基因(本實(shí)驗(yàn)克隆還未登陸)，分別構(gòu)建含有基因片段ZYMV cp，ZYMV nib和ZYMV Hc-Pro 3個(gè)反向重復(fù)植物表達(dá)載體。根據(jù)基因序列和載體上酶切位點(diǎn)，分別添加合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物(表1)。

在載體序列多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別設(shè)計(jì)2個(gè)引物，上游引物為：P5941-F：5′-GGA GAG GAC ACGCTC GAG TAT AAG AGC-3′。下游引物為：P5941-R：5′GCG ATC ATA GGC GTC TCG CAT ATC TC-3′，這2個(gè)引物之一與基因片段其中一個(gè)引物組合，可以確定基因片段的插入方向。反應(yīng)擴(kuò)增體系為25 μL，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5min后，94℃30 s、64℃40 s、72℃40 s 30個(gè)循環(huán)，72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，按照回收試劑盒說明書進(jìn)行。

質(zhì)粒雙酶切：2個(gè)限制性內(nèi)切酶各1.0μL，10×Buffer緩沖液2.0μL，質(zhì)粒4.0μL，補(bǔ)水至20μL，37℃水浴2 h。基因片段雙酶切：2個(gè)限制性內(nèi)切酶各1.0μL，10×Buffer緩沖液2.0μL，含有合適酶切位點(diǎn)的基因片段10.0μL，補(bǔ)水至20μL，37 0c水浴2 h。連接體系：雙酶切后的質(zhì)粒3.0μL，雙酶切后的片段10.0μL，T4 DNA連接酶1.0 μL，10×Buffer緩沖液2.0 IxL，補(bǔ)水至20“L，16℃反應(yīng)12～16 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞DH5a，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒。

1.3 構(gòu)建三價(jià)基因CWZ印植物表達(dá)載體的方法

1.3.1 獲得CWZ cp三價(jià)基因的引物和策略 利用DNAMAN軟件分別比對(duì)CMV、WMV和ZYM cp基因，選CMV cp(376 bp)、WMV cP(464 bp)和ZYMVcp(418 bp)基因的保守區(qū)域，利用重疊延伸PCR的方法獲得CWZcp三價(jià)重組基因片段1 258bp。表2為引物序列。

反應(yīng)擴(kuò)增體系為25μL，擴(kuò)增條件同上。第1輪擴(kuò)增以P1和P2為引物，以pCMV CP為模板得到CMV cp基因部分片段376 bp；以P3和P4為引物，以pWMV CP為模板擴(kuò)增得到WMV cp基因的部分片段464 bp；以P5和P6為引物，以pZYMV CP為模板擴(kuò)增得到ZYMV cp基因的部分片段418bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收。第2輪擴(kuò)增的模板是第1輪擴(kuò)增的回收產(chǎn)物，P1和P4以CMV cp和WMV cp作為模板擴(kuò)增得到CMV-WMVcp；P3和P6以WMV cp和ZYMV cp作為模板，擴(kuò)增得到WMV-ZYMV cp基因序列。第3輪擴(kuò)增則用P1和P6為引物，以第2輪擴(kuò)增的回收產(chǎn)物CMV-WMV cp和WMV-ZYMV印為模板，擴(kuò)增得到含有CMV cp、WMV cp 和ZYMV cp 3個(gè)部分片段的CWZcp 3價(jià)重組基因片段1 258 bp(擴(kuò)增策略見圖1)。并把該基因連入PMDl9-T載體中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞DH5a，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有50 mg·L^-1。氨芐霉素，100μL(20 g·L^-1)X-gal和20μL(100 g·L^-1)IPTG的LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒pCWZCP。

1.3.2 構(gòu)建CWZ cp三價(jià)基因植物表達(dá)載體的引物分析基因序列和載體序列，引入合適的酶切位點(diǎn)反向片段的引物序列pCWZCP-Fh 5′-TTGGCGCGCC G A G TCT TGT CG C AGC AAC-3′，劃線為AscI位點(diǎn)：pCWZ CP-R1 5′-CATG CCATGGTTC AGT GTC TTC GCT AGT-3′，劃線為NcoI位點(diǎn)。添加有合適的酶切位點(diǎn)正向片段的引物序列：pCWZCP-F2：5′CG-GGA-TCC GAG TCT TGT CGC AGCAAC-3′，劃線為BamHI位點(diǎn)；pCWZ CP-R2：5′-TCCCCCGGG TTC AGT GTC TTC GCT AGT-3′，劃線為Sinai位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pFIRZYM V CP、pFIRZYMV NIB和pFIRzYMV Hc-Pro植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為了研究ZYMV病毒的不同基因由RNA介導(dǎo)的沉默效果，構(gòu)建了不同基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體。

對(duì)載體PFGC5941和擴(kuò)增的含有SmaI和Xbal酶切位點(diǎn)的ZYMV cp基因片段分別進(jìn)行SmaI和XbaI雙酶切。回收、連接轉(zhuǎn)化后，篩選陽性克隆，獲得pFSENZYMV CP質(zhì)粒。進(jìn)一步對(duì)pFSENZYMV CP質(zhì)粒和含有NcoI和AscI酶切位點(diǎn)的ZYMV c基因片段用NcoI和AscI酶切。回收，連接轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，獲得反向重復(fù)植物表達(dá)載體pFIRZYMVCP(圖2-A)。

分析nib和Hc-Pro基因序列后，在設(shè)計(jì)引物時(shí)引入了相同的酶切位點(diǎn)，因此nib和Hc-Pro基因的載體構(gòu)建策略相同。對(duì)載體pFGC5941和擴(kuò)增的含有SwaI和A scI酶切位點(diǎn)的ZYMV nib和ZYMVHe-Pro基因片段進(jìn)行SwaI和AscI酶切。回收、連接并轉(zhuǎn)化，篩選。獲得含有反向片段pFASENZYMVNIB和pFASENZYMV Hc-Pro質(zhì)粒。進(jìn)一步對(duì)pFASENZYMV NIB和pFASENZYMV Hc-Pro質(zhì)粒和含有BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)的ZYMV nib和ZYMVHe-Pro基因分別BamHI和XbaI酶切。回收，連接并轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，獲得反向重復(fù)表達(dá)載體pFIRZYMV NIB和pFIRZYMV He-Pro(圖2-B)。

2.2 pFIRZYMV CP植物表達(dá)載體的鑒定

PCR擴(kuò)增以pFIRZYMV CP質(zhì)粒為模板，用基因片段上游引物Pcp-F和載體序列下游引物P5941-R擴(kuò)增，同時(shí)用基因片段上游引物Pcp-F和載體序列上游引物P5941-F擴(kuò)增(圖3-A)，擴(kuò)增結(jié)果和設(shè)計(jì)的片段大小一致，表明該質(zhì)粒已含有正向和反向基因片段。用XbaI與Smal雙酶切pFIRZYMV CP質(zhì)粒獲得正向基因片段：A scI與NcoI雙酶切pFIRZYMV CP質(zhì)粒得到反向基因片段(圖3-B)，酶切成功表明該質(zhì)粒中確實(shí)含有ZYMVcp基因的正向和反向基因片段。

PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定表明成功構(gòu)建了pFIRZYMV CP反向重復(fù)表達(dá)載體。

2.3 pFIRZYMV NIB植物表達(dá)載體的鑒定

PCR擴(kuò)增以pFIRZYMV NIB質(zhì)粒為模板。用基因片段上游引物Pnib-F和載體序列下游引物P5941-R擴(kuò)增，同時(shí)用基因片段上游引物Pnib-F和載體序列上游引物P5941-F擴(kuò)增(圖4-A)，擴(kuò)增結(jié)果和設(shè)計(jì)的片段大小一致，表明該質(zhì)粒已含有正向和反向基因片段。用XbaI與BamHI雙酶切pFIRZYMV NIB質(zhì)粒得到正向基因片段，A scI與NcoI雙酶切pFIRZYMV NIB質(zhì)粒獲得反向基因片段(圖4-B)，分別酶切得到和擴(kuò)增結(jié)果一致的片段。表明該質(zhì)粒中含有ZYMV nib基因的正向和反向片段。

PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定表明成功構(gòu)建了pFIRZYMV NIB反向重復(fù)表達(dá)載體。

2.4 pFIRZYMV He-Pro植物表達(dá)載體的鑒定

PCR擴(kuò)增以pFIRZYMV He-Pro質(zhì)粒為模板，用基因片段上游引物PHc-Pro-F和載體序列下游引物P5941-R擴(kuò)增，用基因片段上游引物PHc-Pro-F和載體序列上游引物P5941-F擴(kuò)增(圖5-A)，擴(kuò)增結(jié)果表明該質(zhì)粒已含有正向基因片段和反向基因片段。用XbaI與BamHI雙酶切pFIRZYMV He-Pro質(zhì)粒得到正向基因片段，A scI與NcoI雙酶切pFIRZYMV He-Pro質(zhì)粒得到反向基因片段(圖5－B)，酶切結(jié)果表明該質(zhì)粒中含有ZYMV Hc-Pro基因的正向和反向基因片段。

2.5.2 pFIRCWZ CP植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以質(zhì)粒pCWZ CP為模板，分別用兩端各帶有2個(gè)酶切位點(diǎn)的引物DCWZ CP-F1和oCWZ CP-R1，pCWZ CP-F2和pCWZ CP-R2擴(kuò)增CWZ cp基因。對(duì)載體pFGC5941和擴(kuò)增含有BamHI和SmaI位點(diǎn)的CWZcp基因片段分別雙酶切。回收連接并轉(zhuǎn)化篩選陽性克隆。獲得CWZ cp正向基因片段的pFSENCWZ CP質(zhì)粒。進(jìn)一步對(duì)pFSENCWZ CP質(zhì)粒和含有NcoI和AscI酶切位點(diǎn)CWZ cp基因片段雙酶切。回收，連接并轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆。獲得反向重復(fù)植物表達(dá)載體pFIRCWZ CP(圖7)。

2.5.3 pFIRCWZ CP植物表達(dá)載體的鑒定PCR驗(yàn)證時(shí)以質(zhì)粒pFIRCWZ CP為模板，以基因片段上游引物pCWZ CP-F1和載體序列上游引物P5941－F擴(kuò)增，同時(shí)用基因片段上游引物pCWZ CP-F2和載體序列下游引物P5941-R擴(kuò)增(圖8-A)，分別擴(kuò)增出和我們?cè)O(shè)計(jì)的大小一致的片段。表明該質(zhì)粒已含有正向和反向基因片段。用BamHI和Sinai雙酶切pFIRCWZ CP質(zhì)粒獲得正向片段：NcoI和AscI雙酶切pFIRCWZCP質(zhì)粒獲得反向片段(圖8-B)，表明該質(zhì)粒中已含有正向和反向基因片段。

PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定都表明成功構(gòu)建了pFIRCWZ CP反向重復(fù)植物表達(dá)載體。

3 討 論

通過構(gòu)建反向重復(fù)植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因在植物體內(nèi)形成dsRNA，引發(fā)病毒同源基因發(fā)生RNA沉默從而使植物獲得抗病毒性。研究表明表達(dá)載體構(gòu)建的方式與基因沉默的效果有關(guān)，正反向重復(fù)目的基因被內(nèi)含子隔開時(shí)，其產(chǎn)生RNA沉默的效率最好，可以達(dá)到100％，而只有正向基因或者只有反向基因的轉(zhuǎn)基因植株由RNA沉默介導(dǎo)的抗病性比含有內(nèi)含子的反向重復(fù)表達(dá)載體低很多，只達(dá)到4％～30％的沉默效果。為了分析同種病毒不同基因RNA介導(dǎo)的抗病毒效果，本研究首先選擇了危害西瓜最嚴(yán)重的ZYMV作為研究對(duì)象，構(gòu)建了ZYMVcp、nib和Hc-Pro基因反向重復(fù)植物表達(dá)載體。期望獲得具有抗病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜新種質(zhì)。利用RNA沉默原理，把病毒的cp基因，nib基因和Hc-Pro基因㈣的正向或反向基因片段導(dǎo)入植株中，研究轉(zhuǎn)基因植株的抗病毒效果已有很多。在本研究中，不是延用前人的做法只是導(dǎo)入正向或反向基因，而是構(gòu)建同時(shí)含有一個(gè)基因的正向和反向序列且這2個(gè)序列被內(nèi)含子隔開的反向重復(fù)表達(dá)載體，這樣有利于在植物細(xì)胞內(nèi)形成穩(wěn)定的dsRNA，從而有效攻擊病毒基因組的同源片段，使病毒RNA降解，達(dá)到較好的基因沉默效果，進(jìn)而能很好的比較3個(gè)基因?qū)τ谥参锏目共《拘Ч罱K獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因西瓜新品系。

針對(duì)目前我國(guó)西瓜生產(chǎn)種植中的多種病毒危害的特點(diǎn)，選擇了危害西瓜的ZYMV、WMV和CMV 3種病毒的外殼蛋白基因作為研究的對(duì)象，重組了同時(shí)含有CMV、WMV和ZYMV cp的部分基因序列的三價(jià)CWZ cp基因。在選擇3個(gè)片段連接起來的方法上，分析發(fā)現(xiàn)如果利用酶切位點(diǎn)連接片段要經(jīng)過多次的酶切和連接，使實(shí)驗(yàn)程序變得復(fù)雜；且基因序列和載體上的酶切位點(diǎn)不能滿足多次的酶切和連接需要，因此我們利用重疊延伸PCR技術(shù)互相嵌套的方法將3者組合一起。利用重疊延伸PCR技術(shù)需要進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增才能獲得目的基因，考慮到多次擴(kuò)增及普通Toa DNA聚合酶易出現(xiàn)堿基改變的特性，在擴(kuò)增CWZ cp基因時(shí)采用了高保真pyrobestDNA聚合酶擴(kuò)增。該基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1個(gè)堿基突變，這和在Taq DNA聚合酶進(jìn)行終止子區(qū)段的改造時(shí)也發(fā)現(xiàn)過4堿基變化是一致的。推測(cè)是DNA聚合酶擴(kuò)增時(shí)帶來的堿基變化，因?yàn)闃?gòu)建的是反向重復(fù)片段的載體，所以推測(cè)1個(gè)堿基變化不影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。在重組了三價(jià)CWZ cp基因后，構(gòu)建了CWZ cp基因的由內(nèi)含子隔開的反向重復(fù)表達(dá)載體。力求在不改變?cè)贩N優(yōu)良性狀前提下，期望選育出兼抗3種病毒的西瓜新品系，為開發(fā)抗3種病毒的西瓜資源提供理論依據(jù)，為培育具有多種抗性的西瓜新品系奠定基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建的植物表達(dá)載體已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404和BH105中，西瓜遺傳轉(zhuǎn)化及抗病毒鑒定工作正在進(jìn)行中。

致謝：感謝武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郭德銀教授和廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局陳紅運(yùn)老師的學(xué)術(shù)建議和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院竺曉平老師提供pFGC5941載體!