核果類果樹遺傳連鎖圖譜的研究進展

摘要：遺傳連鎖圖譜構建是基因組研究中的重要環節，是基因定位與克隆乃至基因組結構與功能研究的基礎。近20 a來，分子生物學特別是分子標記技術的飛速發展為高飽和核果類遺傳連鎖圖譜的構建和利用奠定了基礎。目前國內外已經公布十幾張核果類的遺傳連鎖圖譜，但這些圖譜均有不同的缺陷。因此，我們就核果類遺傳連鎖圖譜的構建進展、性狀的QTL定位及比較圖譜應用進行了綜述，并探討了核果類遺傳連鎖圖譜研究的前景和存在的問題。

關鍵詞：核果類果樹：遺傳連鎖圖譜；分子標記

中圖分類號：S662 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2009)04－532-07

詳細的高密度的遺傳連鎖圖是遺傳學家所追求的理想圖譜，也是分子標記輔助選擇育種的前提和基礎。果樹作物由于高度雜合且世代周期長等特點，要構建一個傳統的遺傳圖譜十分困難，因而果樹的遺傳連鎖圖譜的研究進展緩慢。隨著分子標記技術在植物育種中的廣泛應用，果樹遺傳連鎖圖譜的構建工作得到迅速發展，尤其是核果類果樹大多數基因組較小(如桃基因組僅有3.O×10⁸bp)，其遺傳連鎖圖譜的研究最為迅速。截止目前，國內外已經有超過10張遺傳連鎖圖譜公開發表。果樹遺傳圖譜位點的不斷加密，為解決果樹育種中存在的問題帶來了新的希望，為育種者對控制性狀基因的認識和精確操縱提供了手段，從而把傳統育種和遺傳工程緊密結合起來。我們從用于構建遺傳連鎖圖譜的分子標記類型和方法入手，綜述了核果類果樹遺傳連鎖圖譜的研究進展和應用現狀，并評述了目前存在的問題。

1 已構建的核果類遺傳連鎖圖譜

1.1 構建果樹遺傳連鎖圖譜的方法

分子標記技術的日益成熟和廣泛應用使得高度雜合的多年生果樹遺傳圖譜構建得以實現。RFLP標記具有極高的可靠性，早期的連鎖框架圖幾乎都是利用RFLP標記構建的，它屬于共顯性標記，呈孟德爾式遺傳，能區分雜合位點，結果穩定可靠，重復性好，特別適合于建立連鎖圖譜，不足是RFLP探針的開發較為困難。SSR標記是由簡單序列重復次數的差異引起，通常為共顯性，且一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點，在構建遺傳連鎖圖譜中具有錨定作用。SSR標記同RFLP一樣，如果要開發足夠數量的SSR引物所需費用也很昂貴。由于這2種引物開發困難限制了高密度遺傳圖譜的構建，需要有能夠迅速增加圖譜密度的分子標記，才能使所構建的分子遺傳圖譜具有實際利用價值。RAPD標記數量從理論上講是無限的，而且在染色體端粒及重復順序上也可以找出RAPD標記位點。因此也可用于構建遺傳圖譜。AFLP標記具有多態性強、信息量大、穩定性好等優點，其檢測效率是其他任何一種分子標記所不能比擬的。AFLP標記可以擴增染色體末端標記，填充空隙較大的遺傳圖譜，故AFLP在構建高密度的分子遺傳連鎖圖譜中無疑是一個非常有效的工具。SRAP標記是針對序列相對保守的編碼區與變異大的內含子、啟動子和間隔序列設計引物，對開放閱讀框(open readingframes，ORFs)區域進行擴增的標記，該標記不僅在基因組中分布均勻，而且產生的差異帶將可能包含著可譯框中的外顯子。因此，SRAP標記也將成為構建遺傳圖譜的常用標記。多年生果樹所用遺傳群體材料有限，只有綜合利用多種分子標記技術構建遺傳連鎖圖譜，才能提高圖譜的密度和準確度。

果樹雜合程度高，世代周期長，獲得純系較難等因素制約了果樹連鎖圖譜的構建。“雙假測交”理論㈣是果樹連鎖圖譜構建的理論基礎。目前通常應用較多的群體是F₁群體、F₂群體和BC₁。群體。大部分己構建的果樹遺傳圖譜所用的分離群體一般不超過100個單株，但增大作圖群體是遺傳作圖的發展趨勢。目前常用于構建植物遺傳連鎖圖譜的基本方法是兩點測驗和三點測驗，使用的軟件主要有Gen-Link、MAPMAKER／EXP 3.0、JoinMap2.O、Map Manag-er和MapQTL3.O等。在果樹上以MAPMAKER／EXP 3.0軟件最多，高妍等采用Join-Map3.O軟件的CP作圖模型構建了桃的AFLP分子標記遺傳連鎖圖譜，并認為Join-Map3.O軟件的CP作圖模型能夠增加庫容量，提高作圖效率。

1.2 已構建的核果類遺傳連鎖圖譜

核果類遺傳圖譜的構建研究開始于20世紀90年代初，Eldredge等首先應用RFLP標記開始了桃遺傳圖譜構建的研究。隨著“雙假測交”理論的提出和新的分子標記的發展，目前國際薔薇科基因庫(http：／／www.bioinfo.wsu.edu)已經公布了多種果樹的遺傳連鎖圖譜，如Fiesta×Diseovery蘋果遺傳連鎖圖譜和Housui ×Barflett梨遺傳連鎖圖譜等，其中核果類遺傳連鎖圖譜最多。Dirlewanger等最先利用RAPD標記位點構建了含8個連鎖群的桃遺傳連鎖圖譜，并找到了與油桃型、垂枝型和抗蚜型等經濟性狀連鎖的RAPD標記。隨后國外許多研究者利用不同種、品種間雜交的不同群體相繼建立起李屬的遺傳連鎖圖譜(表1)。Vilanova等利用SSR和AFLP標記構建一張包含211個標記覆蓋602 cM的杏遺傳圖譜。Didewanger等利用扁桃Texasx桃Early－gold的F₂代群體構建了一張含562個標記，總長517 cM，平均密度為0.92 cM的圖譜，是目前李屬密度最大的圖譜，也成為李屬圖譜研究領域的參照圖譜。

我國在核果類分子圖譜構建方面起步較晚.目前僅有桃分子遺傳圖譜構建的報道。喬飛等以北京2-7和白花山碧桃F1代為材料用RAPD和AFLP標記構建了一張遺傳連鎖圖。吳俊等利用大久保和興津油桃雜交F2代的109株群體，也得到了一張遺傳連鎖圖譜。高妍等以油桃品種秦光2號和曙光的91株F1代為試材，采用Join-Map3.0軟件也構建出桃的AFLP分子標記遺傳連鎖圖譜，該圖譜共11個連鎖群，總長1 034 cM，其中包含122個AFLP標記和2個質量性狀標記，標記間平均遺傳距離8.34 cM。但由于這些圖譜多處存在較大空隙和缺少錨定SSR標記，連鎖群標號和次序有待調整。如果能用參照圖譜的SSR標記進行調整核對和加密，可以發揮更大的遺傳分析作用。

2 核果類果樹遺傳連鎖圖譜的應用

遺傳連鎖圖可顯示標記和基因在染色體上的位置，有利于更好地理解基因組結構和進化，是進行基因組系統研究的基礎，也是遺傳學研究的重要領域。在核果類果樹遺傳連鎖圖譜上也整合了很多栽培性狀、果實經濟性狀等，這些都可用于重要質量性狀和數量性狀位點(Quantitative Trait Loci，QTL)的定位和分離、分子標記輔助選擇(Molecular Assisted Se.1eefion，MAS)、基因組比較(compm'afive genomes)等研究領域。

2.1 質量性狀的基因定位

對于質量性狀定位，首先是篩選與被定位性狀共分離的分子標記。若已知該性狀所屬的染色體，則選擇該染色體上的分子標記篩選。若該性狀所屬染色體未知，則從所有染色體上每隔一定距離，均勻抽取分子標記篩選。用這些在相對性狀中表現差異的分子標記檢測分離群體，分析標記與目標質量性狀的分離情況，計算重組值、圖距并確定順序。

核果類果樹質量性狀的基因定位主要借助于分離群體分組分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)來實現。分離群體分組分析法是將分離群體中的個體依據研究的目標性狀(如抗病和感病)分成2組，在每組群體中把各個個體的DNA等量混合，形成2個DNA混合池。由于分組時只對目標性狀進行選擇，因此2個DNA昆合池之間理論上主要在目標基因所在局部區域存在差異，這非常類似于NILs，故也稱作近等基因池法。目前，已有許多核果類果樹農藝性狀的質量性狀基因被標記，如有毛／無毛、白肉／黃肉、黏／離核、抗根結線蟲、葉腺型等(表2)，這些分子標記中許多標記都在輔助選擇育種中得到有效應用。例如，吳俊等㈣利用AFLP技術從京玉、美味正反交F。代群體中篩選到3個與桃果實非酸／酸性狀緊密連鎖的特異擴增片段，并經回收、克隆、測序后將其轉化為重復性好的檢測簡便的SCAR標記。

2.2 數量性狀位點(QTL)定位

果樹的許多重要性狀屬于多基因控制的數量性狀，易受環境影響，傳統的數量遺傳學研究方法對數量性狀基因進行研究。而利用分子標記技術則可以將這些數量性狀基因定位在染色體區段上，實現對單個QTL遺傳效應的追蹤。對QTL進行定位的常用方法有單一標記定位法、區間作圖法、復合區間作圖法等。

目前，已在核果類果樹分子連鎖圖譜上發現許多數量性狀位點(表3)。Sosinki等以桃的3個分離群體為材料，采用RFLP、RAPD和AFLP技術構建了一張包括形態特征、果實品質性狀及砧木特性的復合連鎖圖譜，并確定了影響可溶性固形物、19H、耐冷、成熟與果實大小的12個QTLs(數量性狀位點)，其中7個QTL定位到復合連鎖圖中。Dirlewanger等根據對果實pH值、可滴定酸、糖(蔗糖、山梨醇糖、果糖)、有機酸(蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸)連續2 a的觀測數值進行QTLs分析，結果發現大多數果實成分的QTLs在第5條和第6條連鎖群上均有分布。然而，奎寧酸和糖分的QTLs在不同的年份檢測到的QTLs位點不同，對其表型性狀影響不高。Quana等、Etienne等和Lambert等檢測的QTLs位點都因環境影響等原因致使定位精度不高或遺傳效應低。由于大多數QTL易受環境影響、定位精度不高，單個的QTL遺傳效應低和通用位點信息差等，通常不能直接應用到遺傳育種改良方面。

對于果樹育種而言，驗證在某個雜交組合里發現的QTLs在不同組合和不同遺傳背景下的穩定性是極其重要的，也就是說我們需要發現那些“通用”的QTLs。然而由于缺乏合適的標記系統，驗證不同遺傳背景下QTLs的效應在目前構建的遺傳圖譜的基礎上很難進行。如果能夠利用QTL位點本身作為標記，即利用控制性狀表達的基因作為遺傳標記，連鎖平衡帶來的問題就會大大減少，同時標記輔助選擇的效率也會得到提高。

另外，加大分離群體的數量、繼續增加觀測年份和加大遺傳圖譜的標記密度等方法也能夠提高QTL定位的準確性。QTL定位的作用主要是新基因源的發掘、克隆和主效QTL的分子標記輔助選擇。精細定位數量性狀基因是輔助選擇和QTL克隆的前提，所以。數量性狀定位成為目前核果類重要農藝性狀標記的重點。

2.3 比較基因組

相關物種的基因組均起源于相同的祖先，進化上相近的物種在彼此的染色上存在著同源區段。因此可以利用相同的DNA分子標記在相關物種之間進行遺傳構建或物理作圖，比較標記在不同物種基因組中的分布特點，揭示染色體或染色體片段上的基因及其排列順序的相同(共線性)或相似性(同線性)，并由此對相關物種的基因組結構和起源進化進行分析。Dirlewanger分析核果類各樹種間遺傳圖譜的錨定標記，他們之間有較大的一致性，并作為一個單基因組實體看待。在對T×E圖譜和蘋果P×F比較時，發現2個圖譜共享著多個RFLP標記，存在共線性的連鎖群或片段，并認為核果類基因組和異源四倍體蘋果的2個不同基因組間具有高度的同源性。它們可能起源于一條共同原始染色體。他還在核果類和擬南芥的基因組比較中發現它們之間也存在一定程度的保守序列和相似性。這表明基因及其順序在近緣種較長的染色體區域內是保守的，預示著我們可以建立超越物種界限的大遺傳系統，將近原種作為一個大的遺傳系統進行研究。

不同物種間部分同源關系的研究不僅在起源演化研究上具有重要意義，而且在分子標記育種及基因克隆等方面也有重要的作用。如果幾種樹種具有部分同源關系，那么這幾種樹種的遺傳信息(含連鎖圖)及探針就可以共享。也就是說，比較基因組研究可以顯著增加核果類樹種中可供利用的遺傳標記的數量，這對遺傳研究相對落后的果樹來說是非常重要的。另外，在進行基因克隆時，就可以挑選基因組較小的樹種(桃)來進行，即選擇基因組小的樹種有利于對直向同源基因進行基于圖譜的克隆。一旦某同源基因被克隆和測序。其信息可很快地用于其他植物上同源基因的克隆。因此，桃被作為多年生果樹的模式植物開展遺傳研究。

3 問題及展望

分子遺傳圖譜的遺傳信息利用必須與重要農藝性狀的基因標記結合起來，將2類遺傳標記綜合到一張遺傳圖譜中，不僅是重要經濟性狀準確定位的需要，也是圖位克隆分離目的基因的需要。分子圖譜與經典圖譜的整合主要通過將傳統的遺傳標記基因一個個地定位到分子圖譜中，這就要求所使用的作圖群體包含有較多的分離性狀。為此，應該選擇各種傳統遺傳標記材料為作圖群體，用適當的方法快速找到與傳統遺傳標記緊密連鎖的分子標記，再根據分子標記在分子圖譜上的位置來確定傳統遺傳標記的位置。

雖然我國也有許多實驗室都致力于核果類果樹分子遺傳圖譜構建工作，特別是桃樹遺傳圖譜的構建。但是這些分子標記圖譜之間很少或根本沒有錨定標記，導致在一個圖譜上定位的基因不能整合到另一張圖譜中，不便于與國際核果類信息資源進行比較。由于SSR幾乎都是單座位標記，甚至在具有復雜基因組的作物中亦是如此，它可以準確地定位到基因組中某一位置。如果借助RFLP和SSR等錨定標記將我國所構建的核果類果樹的分子遺傳圖譜能夠與國際參照圖譜聯系起來，將更有利于挖掘和利用我國核果類果樹資源的優異基因，以便培育更加優良的新品種。