24個香菇菌株的鑒定與分類研究

謝雪迎 任鵬飛 朱常香 宮志遠

摘 要:采用拮抗試驗和酯酶同工酶譜分析兩種生物學方法對24個香菇菌株進行鑒定和分類,構建樹狀圖。結果表明:拮抗試驗受外界環境影響大,可用于香菇菌株的初步分類;酯酶同工酶譜帶豐富,可以完成香菇菌株的鑒定,在聚類圖譜0.84的水平上24個香菇菌株可以分為10大類。

關鍵詞:香菇;分類;拮抗;酯酶同工酶

中圖分類號:S646.1+20.37 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2009)12-0036-04

香菇(Lentinula edoeds)是世界上最主要的食用菇類栽培品種之一,在食用菌的產量構成中占有重要地位,1994～1995年世界食用菇類總產量達490×104 t,其中香菇占15%[1]。由于其味美質嫩和具有增強人體免疫功能的特殊作用,香菇已成為全球性備受歡迎的功能食品。

我國是世界香菇栽培的起源地,從發明最原始的“砍花法”以來,迄今已有1 500多年的栽培歷史[2]。我國擁有世界上最豐富的香菇種質資源,在香菇生產的三大要素(菌種、培養料、栽培管理)中,菌種是最重要的基礎生產資料,是影響香菇產量及質量構成的關鍵因子。我國香菇生產快速發展的主要原因之一,就是引進和選育了一大批優質、高產、抗逆性強的菌種。由于目前香菇菌株同名異物和同物異名現象嚴重,故對香菇菌株進行有效的分類和鑒定就成了香菇新品種選育的基礎和前提。本試驗對24個香菇菌種通過拮抗和酯酶同工酶試驗進行了分類和鑒定,旨在為后來的選育工作提供依據[3]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的香菇菌株見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗試驗 挑取大米粒大小的兩菌株種塊于90 mm培養皿內對峙培養,種塊間距1.5～2.0 cm。每個菌株重復3次,于25℃培養20 d,觀察結果并拍照。

1.2.2 菌絲體培養 參考林芳燦的方法[4],將參試菌株在相同條件下接種于PDY液體培養基中進行淺層培養,培養量以各自可以做3個平行試驗為準。

1.2.3 同工酶分析 收集供試菌株菌絲體各3份,液氮研磨。將研磨后的樣品在4℃、10 000 r/min離心10 min,取其上清液。將上清液、蔗糖溶液和溴酚藍指示液按5∶1∶1的體積比混合作為電泳樣品。經SDS-PAGE電泳,取分離膠染色,拍照。

1.2.4 試驗結果的觀察和統計分析 觀察樣品酶帶的位置,計算每條酶帶的相對遷移率(Rf)。Rf按下列公式計算:

Rfn=d璶/d

式中:Rfn為條帶n的相對遷移率;d璶為條帶n的遷移距離(cm);d為溴酚藍的遷移距離(cm)。

同時將凝膠照相存圖。根據菌株每條酶帶的出現與否,計算各菌株間的遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 拮抗試驗

24個香菇菌株共設計拮抗組合276組,拮抗現象不明顯的有25組,占9.1%,其中L26與中香1號、香66-2、856、50826沒有拮抗,親緣關系較近;SNL23與HW021、SNL8、香62親緣關系較近;中香1號與獅子頭、野生香菇親緣關系較近;香939與中香2號、日大親緣關系較近。其它組合的11個菌株拮抗現象比較明顯。因而拮抗試驗結果可將24個香菇菌株初步分為14類(圖1、表2)。

2.2 酯酶同工酶譜分析

提取24個香菇菌株的酯酶同工酶進行聚丙烯凝膠電泳,共得到73條譜帶,各菌株譜帶1～5條不等,相對遷移率介于0.29～0.92之間(見表3)。各菌株間譜帶的深度和寬度有明顯差異,寬且深的譜帶說明酶含量高,活性大;窄且淺的表明酶含量低,活性小。根據譜帶的深淺和寬窄,可將所有譜帶分為四級:一級酶帶色深帶寬;二級酶帶色較深而寬;三級酶帶色較淺而窄;四級酶帶色淺而窄(圖2)。

2.3 聚類分析

根據酯酶同工酶電泳結果,將同一相對遷移率位置上有條帶記為1,無條帶記為0,構建矩陣并用NTSYS進行分析[5]。聚類分析結果(圖3)表明,所有參試菌株在0.68的相似水平上可以歸為一類,在1.00水平上歸為22類,變異范圍為0.68～1.00。在1.00水平上,9015和9508、獅子頭和申香10號相似系數很高,可認為是一個菌株。在0.84水平上分為10大類,其中136.3、856、泌陽3、SNL8、古香66、中香1號各成一類;香62、閔豐1號、9508和9015歸為一類;SNL23、野生香菇、HW021、秋栽6號、香菇939、50826歸為一類;日大、高溫香菇、香66-2歸為一類;申香10號、獅子頭、中香2號、L26、241-4歸為一類。

3 結論與討論

與生化標記、分子生物學標記相比,拮抗試驗結果主觀性強,菌絲生長狀況受外界環境的影響很大,往往使觀察結果與其它鑒定手段相悖。本試驗中,在沒有拮抗線的試驗組合中,也能觀察出菌絲生長狀況的明顯不同,這說明其菌株遺傳背景差異還是有的,只不過沒有在平板上顯現出來而已。所以拮抗試驗只能用于菌株的初步分類。

在生化標記中,酯酶同工酶的穩定性最好,是目前菌種鑒定的常用方法。但酯酶同工酶的測定對培養條件的一致性要求較高,并且不同菌株、不同發育時期、不同部位的酶譜也不一致[6]。故所有處理必須具備相同的培養條件和提取條件,才能保證酶譜分析的客觀性。本試驗中,香菇共同性譜帶不清楚,可能與提取條件有關。

聚類分析通過酶譜條帶的有無構建矩陣,并利用NTSYS軟件繪制樹狀圖、計算相關系數。但在多大的遺傳系數上進行分類最為合理,需要進一步的研究。本試驗的遺傳系數介于0.68～1.00之間,所取的分類點為0.84,是兩者的平均數。

參 考 文 獻:

[1] Chang shu-ting.Mushroon Biology and Mushroon Products[M].Chinese University press,1997,1-10.

[2] 楊新美.中國食用菌栽培學[M]. 北京:中國農業出版社,1988,292-294.

[3] 呂作舟,劉巧云.我國香菇育種的回顧與展望[J].中國食用菌,1996,15(1):5-6.

[4] 林芳燦,高國琪.香菇主要數量性狀遺傳率及相關性研究[J].華中農業大學學報,1993,12(1):27-30.

[5] 蓋均鎰.試驗統計方法[M].北京:中國農業出版社,2000,35-46

[6] 王 鐳,張 婤,潘迎捷,等.利用方差分析和聚類分析法進行香菇種質資源評價[J].食用菌學報,1997,4(3):21-24.