組織工程半月板的研究進展

趙貴慶 崔磊 曹誼林

·綜述·

組織工程半月板的研究進展

趙貴慶 崔磊 曹誼林

軟骨是高等動物體內一種無血管的致密結締組織，由位于軟骨陷窩內的軟骨細胞和細胞外基質構成。根據構成軟骨的細胞外基質成分的不同，軟骨分為透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨。纖維軟骨組織存在于椎間盤、恥骨聯合、半月板、顳下頜關節關節盤以及肌腱與骨的附著部位等處。纖維軟骨的細胞外基質中含有大量呈平行或交叉排列的由Ⅰ型膠原構成的膠原纖維束，軟骨細胞單個、成對或成單行排列，分布于纖維束之間，基質中無定形成分。

半月板是膝關節內兩塊呈新月形的纖維軟骨組織，對膝關節的正常功能有至關重要的作用，它能傳導并分散應力至脛骨平臺、吸收震蕩、提高膝關節的穩定性、增加膝關節運動幅度并促進關節液循環[1]。半月板損傷是骨科的常見病，多由劇烈運動甚至不恰當的負重引起。半月板的外側1/3有來自關節囊的血管滋養，發生在這一區域的損傷具有一定的自我修復能力；發生于內側區的損傷由于沒有血運，其自我修復能力差，損傷往往不能愈合，從而引起疼痛和功能障礙，影響患者的工作生活。遠期的病理的改變主要是關節軟骨的退行性改變，表現為骨關節炎的癥狀[2]。目前，越來越多的外科醫生認識到半月板對于膝關節功能的重要性，針對的治療措施是以盡可能地保留半月板為原則采用半月板修復術，無法修復的半月板常被部分或全部切除，這種措施雖然可以暫時緩解疼痛，但并不能逆轉或阻止關節軟骨退行性改變的發生。對半月板全切術后的患者采用同種異體半月板移植是一種可能的選擇，對延緩關節軟骨退行性改變的發生有一定的作用。但是，同種異體半月板移植供體有限，存在著疾病傳播的可能，且半月板的形態個體之間存在差異，隨訪發現移植后的半月板有收縮的趨勢[3]。

組織工程的發展為半月板缺損的治療提供了新的思路，成為基礎和臨床研究的熱點。基于組織工程原理的治療措施包括：應用種子細胞促進半月板損傷的愈合；應用天然或人工合成的半月板假體替代切除的半月板組織；體外構建組織工程化半月板，然后植入體內，實現半月板的再生。本文就組織工程半月板研究的現狀進行綜述。

1 種子細胞

理想的組織工程半月板種子細胞，應來源于自體細胞，分布廣泛、取材方便、對機體損傷小，體外增殖能力強并不易老化，且能產生大量的細胞外基質。

半月板纖維軟骨細胞是最早被研究用來作為種子細胞的。Webber等[4]于1985年首次報道了半月板纖維軟骨細胞體外培養和增殖的特性，并根據細胞的形態，提出半月板纖維軟骨細胞是是由兩類性質不同的細胞構成。半月板纖維軟骨細胞在體外無支架、高密度培養條件下，并不像透明軟骨細胞那樣可以形成軟骨組織，形成的組織類似于半月板的纖維結締組織部分，僅有少量的蛋白多糖和Ⅰ型膠原的分泌[5-6]。纖維軟骨細胞與Ⅰ型膠原支架材料復合在體外培養3周后，支架內部的細胞呈圓形或橢圓形，細胞周圍有基質形成，但未見有軟骨陷窩結構的形成[7]。但是將其接種在PGA支架或藻酸鈣凝膠中，細胞材料復合物可以在裸鼠皮下形成纖維軟骨樣組織[8]。應用半月板纖維軟骨細胞作為種子細胞接種支架材料修復半月板全缺損或部分缺損的實驗顯示，細胞材料復合物在體內3～6個月后能形成與正常半月板組織相似的纖維軟骨組織，具有半月板的白區和紅區的組織學特征[9-11]。研究所用的細胞都是從幼年動物的半月板中分離培養的，其增殖和產生細胞外基質的能力較強。大多數半月板損傷的病人是成年人，其半月板源性纖維軟骨細胞的GAG和膠原合成能力以及體外增殖能力隨著年齡增長而顯著降低[12-14]。體外培養的半月板細胞隨著擴增倍數的增加其成軟骨的能力逐漸減弱，體外擴增3～4代后，細胞僅合成Ⅰ型膠原而不合成Ⅱ型膠原，表現為成纖維細胞的特性[12]。采用自體半月板細胞要求患者接受兩次手術，第一次用開放手術或關節鏡取出受損的半月板組織用于種子細胞的分離培養，經過一段時間的體外培養，形成可回植的組織工程半月板后，再次手術修復半月板的缺損，整個治療周期較長，而且從患者的損傷半月板中分離的纖維軟骨細胞數量有限，難以滿足組織工程半月板構建對種子細胞量的需求[15]。應用同種異體半月板纖維軟骨細胞修復兔半月板缺損的實驗表明，在回植后6～10周后，植入物有少量的炎性細胞浸潤，36周后形成類似半月板的纖維軟骨組織，植入物周圍沒有明顯的炎性肉芽組織形成[16]。該結果提示，半月板組織尤其是半月板的內側無血管區可能具有免疫豁免的特性，同種異體的半月板細胞可以在此部位存活并發揮正常的生理功能。但是要獲取人的同種異體半月板細胞還受到供體來源的限制。顯然，半月板纖維軟骨細胞并不是一種理想的組織工程半月板種子細胞。

關節軟骨細胞是組織工程化軟骨構建中研究得最多的種子細胞。關節軟骨細胞在體外單層培養擴增期間，細胞逐漸表達Ⅰ型膠原，表達Ⅱ型膠原的能力下降，而這正是纖維軟骨細胞區別于透明軟骨細胞的特點之一。透明軟骨細胞在體外三維培養條件下能產生6倍于纖維軟骨的GAG，其膠原的合成能力也強于后者[17]。Peretti等[18]將豬的關節軟骨細胞作為組織工程半月板的種子細胞，接種在滅活的同種異體半月板材料上修復自體半月板缺損，9周后實驗組有愈合的表現，而對照組無一愈合。Weinand等[19]將豬的關節軟骨細胞和耳軟骨細胞體外分離擴增后，接種在Vicryl mesh支架上，植入自體或異體半月板無血管區的圓形缺損處（直徑1 cm），12周后不論自體還是異體缺損都得到很好的修復。但是，關節軟骨細胞在體外擴增后會去分化為僅分泌Ⅰ型膠原的細胞表型，GAG的合成能力也明顯降低[20]；另外，關節軟骨的獲取需要損傷功能上更為重要的關節面，因此關節軟骨細胞將不會被作為組織工程化纖維軟骨的種子細胞而應用于臨床。

干細胞具有旺盛的體外增殖能力和定向分化特性，因而成為了眾多學者的研究方向。骨髓基質干細胞（BMSC）是一種成體干細胞，容易獲得，可以體外擴增、定向（多向）誘導分化。TGF-β是誘導BMSC向軟骨細胞分化的重要生長因子，單層培養條件下，2周后表達Ⅱ型膠原[21]。應用TGF-β誘導的BMSC可以修復豬關節非負重區的軟骨缺損，表達軟骨特異的細胞外基質成分[22]。從骨髓中分離的單核細胞注射于半月板裂傷部位，可以促進半月板損傷的愈合[23]。BMSC可以在半月板的無血管區存活，并產生細胞外基質[15]，在支架材料上體外三維培養較半月板纖維軟骨細胞在相同條件下能產生更多的膠原和GAG[24]。Angele等[25]用兔的自體BMSC作為種子細胞，接種于透明質酸酯和凝膠構成的支架材料上，體外培養2周，回植入內側半月板中份5 mm的缺損處，回植后12周，實驗組明顯優于單純支架對照組，有纖維軟骨樣組織形成。徐青鐳等[26-27]應用兔的BMSC作為種子細胞，在體外擴增并用bFGF和TGF-β1誘導，然后接種于膠原-GAG支架上植入體內，術后3～6個月，形成纖維軟骨樣組織，有軟骨陷窩形成，細胞外基質中有大量平行分布的膠原纖維束和酸性黏多糖。雖然BMSC有自發成骨的傾向，體內實驗中發現有部分新生的纖維軟骨內有肥大軟骨細胞和骨形成[28]，但是應用適當的誘導方案，BMSC是較有臨床可行性的組織工程纖維軟骨種子細胞。

胚胎干細胞具有無限增殖能力和全能分化潛能。體外研究顯示，胚胎干細胞在一定的誘導條件下，可以表達Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和GAG，表現出向纖維軟骨分化的特性[29]。但由于受到醫學倫理等的制約，目前尚缺乏進一步的研究。

成纖維細胞是源于中胚層的一種間質細胞，其廣泛存在于機體的各種組織中，被認為是具有組織特異性的背景細胞[30]。真皮成纖維細胞是皮膚中含量最為豐富的一種細胞，它表達Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ型膠原和透明質酸、彈性蛋白、多能蛋白聚糖（Versican）、核心蛋白多糖（Decorin）以及層黏連蛋白等[31]。

真皮成纖維細胞在一定的培養條件和誘導因子作用下可以向骨[32]、軟骨[33-43]、成肌纖維細胞[44-45]、角膜基質細胞[46]分化，表現出多潛能分化的特性。成體皮膚成纖維細胞經過胰島素預處理后，接種在有聚集蛋白多糖涂層的培養皿上，能表達更多Ⅱ型膠原和Aggrecan[34]。人皮膚成纖維細胞在含有脫鈣骨粉的膠原三維支架中培養，具有向軟骨分化的趨向[35-36，41-42]。低氧環境有助于成纖維細胞分泌軟骨特異的細胞外基質[40]。在低氧條件下當培養液中含有40 mM的乳酸時可以誘導其表達軟骨特異的細胞外基質[43]。低氧和蛋白激酶C阻滯劑聯合作用，可以使成纖維細胞分泌軟骨細胞表型的基質[47]。應用SOX5、SOX6、SOX9聯合轉染人皮膚成纖維細胞3 d內即有Ⅱ型膠原和Aggrecan表達[37]。人的真皮成纖維細胞與豬的軟骨細胞在三維條件下共培養，形成軟骨樣組織，一部分真皮成纖維細胞轉分化為軟骨細胞[48]。本實驗室早期的研究發現，人的皮膚成纖維細胞在軟骨源性形態發生蛋白-1(CDMP-1)的作用下能分泌軟骨特異的細胞外基質（Ⅱ型膠原和Aggrecan）；在高密度無支架三維培養條件下，軟骨細胞的表型可以長期維持[33]。皮膚成纖維細胞取材簡便、繼發損傷小、體外增殖合成能力旺盛、經多次傳代仍保持較好的增殖能力，是一種較理想的構建組織工程半月板的種子細胞。

2 支架材料

理想的半月板支架材料應當具有良好的生物相容性和生物可降解性，而且應當有提供細胞黏附生長和產生細胞外基質的空間結構，營養物質在支架中的擴散效率能提供相對穩定的適宜的細胞代謝所需的化學環境，能結合細胞生長所需的刺激性或抑制性細胞因子。另外，支架材料要具有一定的機械強度，能適應關節內的力學條件而保持結構的完整性[3]。

基于上述因素的考慮，已有多種生物材料被用于組織工程半月板的構建研究。其中，天然生物材料包括纖維凝塊、骨膜、軟骨膜、肌腱、小腸黏膜下層、膠原制品以及滅活的同種異體半月板組織。纖維凝塊是最早應用于半月板的生物材料，Arnoczky等[49]于1986年應用外源性的Fibrin blot修復狗的半月板撕裂模型。1990年，Henning等[50]將該技術用于臨床，在術中獲取患者的自體血，體外形成凝塊后，注射在半月板撕裂處以促進損傷的愈合。進一步的研究表明，半月板細胞可以向纖維凝塊內遷移，并合成細胞外基質[15]，半月板纖維軟骨細胞與纖維凝塊混合可以在體內促進半月板損傷的愈合[51]。骨髓基質干細胞也可以在纖維凝塊內存活并增殖，體內實驗顯示能促進新生半月板樣組織的形成[52]。骨膜組織植入半月板缺損區后不能形成纖維軟骨組織，而是形成一個覆蓋著透明軟骨組織的楔形骨組織[28]。這顯然與骨膜中含有的大量成骨細胞有關，在關節內環境中表現為軟骨內成骨的過程。而自體肋軟骨膜植入半月板全缺損模型后，可以形成纖維軟骨樣組織，組織學形態與正常半月板極為相似[53]。脂肪細胞[54]、肌腱細胞[55]在關節內也會形成纖維軟骨樣組織，而且對關節軟骨有一定的保護作用。但是這些組織的力學強度有限，植入早期不能承載膝關節內的壓力強度，往往導致半月板的內側緣不能形成，對關節軟骨的保護作用有限，以致遠期都會產生骨關節炎的癥狀。

來源于天然膠原的生物材料具有良好的組織相容性、低抗原性、生物可降解性[7]，在制藥和生物材料領域得到了深入研究和廣泛應用，并已有多種膠原產品得到批準而用于臨床。膠原半月板支架材料也是研究最為成熟的半月板替代物。未交聯的膠原支架材料較化學交聯后的支架材料具有更好的生物相容性[56]，植入半月板缺損部位后可吸引關節內的細胞浸潤生長，最終可以形成纖維軟骨組織[57]。由Ⅰ型膠原、硫酸軟骨素和透明質酸復合生產的膠原半月板植入物（CMI）,已應用于臨床。CMI表現出良好的治療效果，形成了纖維軟骨組織[58]，明顯改善了患者膝關節的癥狀，延緩了關節軟骨的退行性改變。將CMI接種上羊的自體半月板細胞修復半月板全缺損模型，結果顯示實驗組新生半月板在血管化、塑形、基質含量等方面優于未接種細胞的對照組[10]。徐青鐳等[27]應用膠原-糖氨聚糖支架負載骨髓基質干細胞修復自體半月板缺損，形成了半月板樣纖維軟骨組織。

除了天然生物材料之外，許多學者對人工合成的高分子聚合物生物材料作為組織工程化纖維軟骨的支架材料也進行了深入的研究，其中研究最多的是聚羥基乙酸（PGA）和聚乳酸(PLA)。PGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解產物羥乙酸對細胞無毒性作用，可最終代謝為CO2和H2O。PGA纖維可以通過PLA的有機溶劑塑形，提高支架材料的力學性能[16]。PGA的孔隙率較大，而且降解速度可以人為控制，是研究纖維軟骨細胞在三維條件下的生物學行為的良好的載體[59-60]。以PGA-PLGA構建的支架材料負載同種異體纖維軟骨細胞實現了兔全半月板的構建，支架材料完成降解[16]。其他用于組織工程纖維軟骨的高分子生物材料還有聚酯和高分子水凝膠。為了提高材料的生物活性和力學性能，越來越多的研究關注于天然材料與人工合成材料復合生物材料的研究。天然材料具有良好的生物相容性，但是力學強度不能達到生理半月板的功能要求，而人工合成的材料往往具有良好的機械性能，但其生物活性不高，復合材料就是利用兩者的優點，形成既具有一定力學強度又有良好生物活生的支架材料，如Ⅰ型膠原涂層的聚酯類生物材料[61]、含有透明質酸和聚己酸內酯的支架材料[62]等。

3 生長因子

生長因子是指能促進細胞增殖、分化、成熟的細胞因子。目前，用于組織工程纖維軟骨的生長因子已經有很多種。轉移生長因子-β1（TGF-β1）是研究最多的生長因子，它可以促進體外單層培養[63]和三維培養[60，64]的半月板纖維軟骨細胞分泌膠原和GAG，維持纖維軟骨細胞的表型。其作用強于胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）、PDGF-AB血小板源性生長因子-AB（PDGF-AB）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。TGF-β針對PGA支架材料上三維培養的羊半月板纖維軟骨細胞，主要是促進其Ⅰ型膠原的合成，對Ⅱ型膠原的合成沒有促進作用[64]；而對藻酸鹽凝膠中三維培養的人半月板纖維軟骨細胞有明顯的促進其Ⅱ型膠原合成的作用[65]。這種差別可能是由于藻酸鹽凝膠培養條件更接近于纖維軟骨細胞的生理環境，有助于細胞表型的維持。TGF-β是通過抑制結締組織生長因子（CTGF）的表達來發揮其生物效應的。CTGF是胚胎時期誘導組織形成的重要生長因子，能促進成纖維細胞的增殖。TGF-β通過抑制細胞的增殖，促進細胞分化和合成功能，分泌和沉積細胞外基質[66]。TGF-β與其他生長因子聯合應用可以使多潛能細胞向軟骨細胞分化，表達軟骨特異的細胞外基質成分。TGF-β與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[26]、胰島素樣生長子-1(IGF-1)[67]能產生協同作用，以誘導間充質來源的細胞向軟骨細胞表型分化。

軟骨源性形態發生蛋白（CDMPs）是骨形態發生蛋白（BMP）家族中的新亞型，也是TGF-β亞群中的一個成員。CDMP-1是四肢骨發育，尤其是早期軟骨發育的重要調節因子，能促進間質細胞的聚集和向軟骨分化。該基因的缺陷可以引起四肢骨，尤其是肢端的發育障礙[68]。CDMP-1能誘導體外培養的韌帶成纖維細胞和皮膚成纖維細胞向軟骨細胞表型分化[69，33]。CDMP-1轉染的骨髓間質干細胞可以促進關節軟骨缺損的愈合[70]。TGF-β與CDMP-1聯合，可以誘導人胚胎來源的骨髓基質干細胞表達Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和GAG，使之分化為纖維軟骨細胞[71]。這表明，CDMP-1是間充質來源細胞向軟骨細胞分化的重要生長因子。

表皮生長因子（EGF）是從來自鼠頜下腺的神經生長因子中發現的。在離體培養實驗中，EGF對成纖維細胞和內皮細胞具有促有絲分裂作用。它與TGF-β具有相同的受體,兩者協同可以促進細胞的增殖，有助于組織工程半月板的血管化。腺病毒載體編碼的肝細胞生長因子（HGF）轉染半月板細胞可促進細胞材料復合物血管化[72]。HGF與PDGF聯合應用，可以趨化半月板細胞向損傷部位遷移并產生細胞外基質[73]。

在成體干細胞或分化細胞向軟骨細胞分化的過程中，外源性細胞因子的加入發揮著不可或缺的作用[28]。選擇適當的細胞因子在組織工程半月板的構建過程中具有重要的意義。

4 力學因素

半月板在膝關節內起著應力傳導、穩定和潤滑關節的作用。半月板的外側紅區組織學上與肌腱相似，是由Ⅰ型膠原構成的致密結締組織構成，主要承受拉力負荷；內側白區則與透明軟骨和肌腱的腱帽相似，主要承受壓力負荷[1]。應力刺激是半月板發育過程中必不可少的條件之一。雞胚中雖然可以看到發育的半月板，但是半月板是卷曲退化的，即使是完全發育的半月板，經過一段時間的固定后也表現出退化的傾向[1]。對離體半月板機械刺激顯示，靜態壓力能抑制膠原和糖蛋白前體的攝取，而動態變化的壓力則具有較高的蛋白多糖的表達。應用生物反應器對細胞懸液中的膠原材料施加壓力負荷，結果實驗組細胞的浸潤和組織的再生均不如對照組[56]。對骨髓基質細胞與支架材料復合物施加周期性的動態壓力刺激可以上調膠原和蛋白多糖的表達水平，促進細胞外基質的分泌[74]。組織工程半月板應用于臨床必須達到3個力學要求：①新生的半月板組織達到生理半月板的力學強度；②新生半月板的幾何形狀與受體的關節相適應；③新生半月板回植后能與脛骨平臺很好的連接[75]。力學刺激對于提高組織工程化半月板的機械強度有著不可代替的作用[76]。由于生物反應器的研究滯后，對于如何施加力學刺激、何時施加，以及力的強度等，都還有待進一步的研究。

5 展望

組織工程研究要從實驗室研究走向臨床應用還面臨著巨大的挑戰。第一，如何有效地對人體組織進行成規模的體外培養；第二，如何構建能滿足體內力學要求的成熟的功能化組織工程組織[76]；第三，如何將構建的組織工程化組織植入體內，發揮其生理功能。組織工程半月板也面臨著同樣的問題。選擇合適的種子細胞，并體外構建成熟的組織工程半月板將是以后研究的重點。

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Q813.1+2

B

1673－0364（2009）03－0166－05

2008年10月25日；

2009年2月3日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.015

410000湖南省長沙市亞韓醫學美容醫院（趙貴慶）；200235上海市上海組織工程研究與開發中心（崔磊，曹誼林）。