不同種子細胞在組織工程膀胱構建中應用的研究進展

朱衛東 徐月敏

不同種子細胞在組織工程膀胱構建中應用的研究進展

朱衛東 徐月敏

組織工程膀胱構建的研究為膀胱缺損的修復提供了新的選擇，它避免了傳統的腸道代膀胱引起的代謝紊亂、感染、結石形成等并發癥。組織工程膀胱構建研究中，種子細胞的選擇、體外培養及擴增是關鍵，是成功構建組織工程膀胱必不可少的條件[1]。理想的種子細胞應該具備來源廣泛、易獲得，體外易于培養擴增，與支架材料相容性好等優點。本文主要就不同的種子細胞在組織工程膀胱構建研究中的應用進展進行綜述。

1 自體成體細胞

通過膀胱組織活檢，獲取一定數量的自體成體細胞，操作簡單，損傷小。在研究早期，正常的上皮細胞可以在實驗室生長，但在體外難以大量擴增，老化問題難以克服，從而限制了研究的進展。2006年，D iego等[2]通過角質上皮培養技術使得移行上皮細胞在體外得到了大規模擴增，大大加速了膀胱組織工程的研究進展。同時，體外培養的上皮具有抵抗尿液基本成分的屏障作用，適用于組織工程膀胱的構建，更加推動了組織工程膀胱研究的發展。Kurzrock等[3]將小鼠3T3細胞作為膀胱上皮細胞（Urothelial cells，UROs）原代培養的滋養層細胞，成功地將大鼠UROs體外連續培養超過10代，并且冷藏和復蘇對UROs的活性無明顯影響。Moriya等[4]將UROs與膀胱黏膜下層（Bladder acellular matrix graft，BAMG）復合培養后，異位回植到膀胱部分切除的大鼠的腸系膜上，術后7 d，α-SMC-actin或索蛋白（Desmin）陽性的間質細胞長入BAMG，透射電鏡下此間質細胞為肌纖維母細胞，術后14 d和28 d轉變為平滑肌樣細胞，術后56 d，進一步轉變為纖維細胞。這說明長入BAMG的間質細胞逐漸失去平滑肌細胞的特點，單純UROs存在的環境不能維持平滑肌樣間質細胞的表型。Frey等[5]將膀胱上皮細胞和平滑肌細胞混合后種植于合成的水凝膠支架上進行聯合培養，證明分層培養和“三明治”樣培養技術能誘導有序的細胞排列、有規律的假覆層尿路上皮形成和增加多層的平滑肌基質，而單獨種植平滑肌或者尿路上皮細胞都沒有觀察到細胞長入支架。Asharf等[6]將豬的膀胱上皮細胞及平滑肌細胞接種于去黏膜結腸用于構建膀胱組織，修補膀胱缺損。結果顯示修補區域被完整的上皮組織覆蓋，而無纖維化形成。而單純用去黏膜結腸修補則會形成大量瘢痕，且修補區無上皮組織覆蓋。因此，他們認為接種細胞能夠抑制內在的纖維化和去黏膜結腸的攣縮。Han等[7]采用酶消化法得到膀胱平滑肌細胞，可以在體外大量擴增且能保持其原本細胞形態學、生物學特征，同時能與支架很好地黏附，為獲得更好的平滑肌細胞作為種子細胞提供了途徑。

Udo等[8]學將膀胱沖洗液離心，沉淀后得到的細胞用表皮生長因子培養液體外培養，能夠形成復層的上皮結構，表達AE1/AE3等上皮特異性抗體。

除了泌尿系統本身細胞，以自身的其他組織的細胞作為種子細胞進行膀胱構建研究也有報道。Lai等[9]將兔小腸的平滑肌細胞作為種子細胞在體外擴增后用于膀胱構建，與膀胱平滑肌細胞相比，在免疫組化、收縮性及形成的膀胱容量等方面均無明顯差異。因此，他們認為小腸的平滑肌細胞同樣可以作為組織工程膀胱構建的種子細胞，且具有來源廣泛，數量多等優點。Bernhard等[10]將豬皮膚完全分化的角化上皮和成纖維細胞分別體外擴增后接種于自體帶血管蒂去黏膜回腸片的兩面以構建膀胱，術后3個月檢測其攣縮率為6.5%，新構建的膀胱壁的膨脹性稍差，且沒有形成結石等并發癥。

2 干細胞

很多病理情況下，如膀胱外翻、膀胱發育不全及膀胱惡性病變時，自體膀胱組織不能提供正常功能的種子細胞。最近亦有研究發現，體外培養的神經性膀胱患者的膀胱平滑肌細胞（Bladder smooth muscle cells，BSMCs）生長、分化、黏附及收縮性能均較正常BSMCs差，也不適合作為組織工程膀胱的種子細胞來源[11]。另有研究認為，正常的自體成體細胞有許多不足，如體外培養增殖速率過慢、體外培養后其原有功能會出現明顯降低等[12]。干細胞在一定程度上彌補了上述缺陷。干細胞具有高度增殖和自我更新能力，且具有多向分化潛能，是理想的種子細胞來源。目前，由于醫學倫理方面存在著爭議，胚胎干細胞在組織工程膀胱構建方面的研究幾乎處于空白，研究焦點主要聚焦于各種成體干細胞，其中間充質干細胞是研究最為廣泛的。其取材范圍包括脂肪組織、骨膜、滑囊囊壁、肌肉、真皮、骨髓等。其中通過骨髓穿刺抽取所獲得的骨髓間充質細胞，易培養，便于篩選，且可以向軟骨細胞、成骨細胞、表皮細胞、神經細胞和其他一些間充質來源的組織細胞分化[13-14]。Hegnera等[15]證明骨髓源性的干細胞在體外可以向平滑肌細胞進行分化，表達出平滑肌肌動蛋白等平滑肌細胞所特有的標記，為間充質干細胞進一步在組織工程膀胱中的應用提供了很好的思路。

Zhang等[16]采用犬骨髓基質細胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）來構建膀胱組織，結果顯示構建組織在體外呈現鈣離子依賴性收縮反應，收縮性與膀胱平滑肌相似，且同樣表達α-SMC-actin等平滑肌特異性標記物；植入犬體內后10周，可有平滑肌束生成。Chung等[17]將33只小鼠分為4組，一組為對照組，一組為部分膀胱切除加單純縫合組（OG），一組用單純SIS進行膀胱擴大重建（USG），剩余一組采用骨髓間質干細胞-SIS復合物行膀胱擴大術（SSG）。術后1個月發現，在USG組和SSG組中出現與對照組相同的緊密細胞群，而在SSG組中更可見到基底細胞層中有明顯增生的尿路上皮細胞。3個月后，各組中均出現了尿路上皮的增生和肌束的形成，同時還伴有神經染色陽性。RT-PCR發現，SSG組中CⅠ、CⅢ和MHC的含量明顯高于USG組。

脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)取材方便，來源廣泛，且比其他成體干細胞具有更高的增殖率及向其他類型細胞的分化能力[18]。Gregory等[19]將經綠色熒光蛋白標記的脂肪干細胞注入大鼠膀胱壁內，4周后發現經標記的脂肪干細胞長入膀胱壁的平滑肌內，12周后表達α-平滑肌肌動蛋白等平滑肌特異性標記物。

Shing等[20]將肌源性干細胞(Muscle-derived cell)種植于SIS之上，證實肌源性干細胞可以在無細胞基質上生長并能提供一定的張力,為其作為組織工程膀胱的種子細胞提供了可能。Yokoyama等[21]將鼠的肌源性干細胞分離培養后，分別回注膀胱左右側壁，于5 d、35 d、70 d分別取出膀胱壁行重型肌球蛋白鏈及β-半乳糖苷酶染色，顯示均為陽性，證實注入的細胞可以長期存活，并可以轉化為平滑肌。

Oottamasathien等[22]將經擴增的尿路上皮細胞與孕14 d的胚胎小鼠的膀胱間充質細胞復合，片狀埋入免疫缺陷小鼠的腎周，28 d后取出。通過免疫組化染色發現，有成熟的尿路上皮細胞和間質細胞的分化。而單獨種植尿路上皮細胞和膀胱間質細胞均沒發現膀胱組織。

Ominic等[23]為胚胎源性的干細胞與膀胱平滑肌細胞、尿路上皮細胞共同培養，或者各自單獨培養。8 d后顯示，干細胞單獨培養的生長速度為0.3～0.7 mm/d，與之同樣培養的平滑肌細胞生長速度為0.1～0.3 mm/d，而尿路上皮為0.1～0.2 mm/d。將上述細胞混合培養，干細胞的生長速度提高至0.5～1.0 mm/d。另外，干細胞單獨培養時呈環狀生長，而混合培養時呈線性生長，提示干細胞在與其他細胞聯合培養時可能釋放出一些趨化信號。Coppi等[24]的研究也獲得了相似的結論，他們在凍傷膀胱的膀胱壁上注射入骨髓間質干細胞以觀察其對膀胱的修復情況。細胞植入后30 d，僅有很少的干細胞轉化為平滑肌細胞，大部分細胞失去了特異分化的能力，且彼此融合。但是，這些干細胞的存在阻止了一般膀胱損傷后會發生的平滑肌細胞肥大現象。

3 展望

目前的臨床技術，對于膀胱的缺損修復以及功能重建尚有很大的不足。組織工程膀胱構建的可能性給臨床患者帶來了新的希望。隨著組織工程膀胱構建研究的深入，各種原因導致的膀胱缺損，將會獲得更好地修復。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）03－0171－03

2008年7月15日；

2008年8月31日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.016

200233上海市上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院泌尿外科。