豬偽狂犬病毒的分離鑒定及TK獨立基因的測序分析

偽狂犬病是由皰疹病毒科α亞科中的Ⅰ型皰疹病毒所引起的多種家畜和野生動物以發熱、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀的高度致死性疾病。豬是本病毒最重要的貯存宿主和傳染源。豬感染偽狂犬病毒后的癥狀因日齡不同而異，妊娠母豬感染后引起流產，產木乃伊胎和死胎；哺乳仔豬感染后出現神經癥狀，麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達100%。成年豬一般為隱性感染，不表現臨床癥狀，但病毒可在豬體內保存很長時間[6]。該病在豬群中具有傳播快、死亡率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點。我國自1947年劉永純[1]首次報道以來，隨著養豬業集約化、規模化的發展，已有20多個省、市相繼報道過本病。該病屬于典型且極難防疫的自然疫源性疾病之一。近幾年豬偽狂犬病在我國許多省市種豬場呈爆發流行趨勢[2,3]，已成為危害中國養豬業最嚴重的疫病之一，造成了巨大的經濟損失[4,5]。

豬偽狂犬病毒基因組為線狀雙鏈DNA，在核內DNA以高分子量的連環體存在，核苷酸鏈長度約為150kb，基因由獨特的長區段（UL）和短區段（US）及位于US兩側的末端重復序列（TR）和內部重復序列（IR）所組成，大約可編碼70-100種蛋白質。其中胸腺激酶（TK）基因是偽狂犬病毒的非必需基因同時也是主要的毒力基因之一，它與病毒在機體中的潛伏感染和神經組織中的增殖有關[7,8]。

本實驗室從某豬場送檢的肺、脾、腎等病料中分離鑒定出1株偽狂犬病毒，對其進行TK基因測序，并與國內外其他分離株進行了序列比較，旨在弄清偽狂犬病毒流行特點、來源及其他毒株的親緣關系等，為該病的分子流行規律、遺傳變異、疾病防控及基因工程疫苗的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Ik88u病料 病料采集于2014年6月，病料來源于某臨床病例疑似偽狂犬病病豬的肺、脾、腎等組織。

1.1.2 主要試劑 DL2000 DNA Maker、rTaq with GC Buffer購自寶生物工程有限公司。病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒購自博邁德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料組織的處理 無菌的取病料剪碎后加入PBS(0.1 mol/L，pH 7.2)，用組織研磨棒研碎，制成1:5的懸液，反復凍融3次，12000r/min 離心15min，取上清，-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物的設計與合成 引物參照周斌等[9]建立的PCR體系所涉及的序列，擴增部分gE基因，擴增片段長度為850bp。引物序列為：上游引物：5‘CCCTGGACGCGAACGGCACGATG3’，下游引物：5’GGGTGGCACGCGCTCTCGAAGCA3’。 引物根據GenBank已公布的PRV TK基因序列，通過Primer 5.0生物軟件設計出一對引物，上游引物：5‘AGGCGTTCG TAGAAGCGGTTGT3’，下游引物：5’GCACGGCAAACTTTATTGGGAT3’。預期擴增片段長度為1400bp。引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA的提取及PCR鑒定 將上述處理的病料組織液，用博邁德的病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒提取病毒DNA作為模板，利用上述引物分別擴增PRV gE、PRV TK 基因片段。PCR總體積為25μL，反應體系如下：2×GC Buffer 12.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，模板 DNA 2μL，上游、下游引物各0.5μL，rTaq DNA聚合酶 0.5μL，去離子水 7μL。PCR 反應程序均為：94℃ 5min；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 1min30s，30 個循環；72℃延伸 10min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，其余產物進行膠回收。PRV TK膠回收產物送上海英俊生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.4 PRV TK基因序列分析 用DNAMAN軟件對測得的此病料的PRV-TK基因核苷酸序列和推導出的氨基酸序列進行分析，并與GenBank中收錄的偽狂犬病毒Bartha 株、FS170株、LA株、Min-A株、SA株、SL株的TK基因進行同源性分析。

2 結果

2.1 PCR鑒定 用gE基因設計的引物進行PCR擴增，結果在850bp左右有一特異性條帶（圖1），與預期結果相符。結果表明所分離病毒為偽狂犬野毒。命名為YF株。

圖1 M:Trans 2k Maker

2.2 PRV TK基因的擴增 PRV TK基因的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察可見一條大小約為1400bp的特異性條帶，大小與預期相符（圖2）。

圖2 M:Trans 2k Maker

2.3 PRV TK基因序列分析 經測序，擴增的此株TK基因片段長為1400bp,包含一個963bp的開放閱讀框（ORF），編碼320個氨基酸。用DANMAN將該ORF序列同GenBank上發表的其他毒株的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行同源性比較分析（表1、2）。結果顯示，此株與其他毒株核苷酸的同源性為98.4%-100%，而各毒株氨基酸的同源性為96.6%-100%，并且根據YF株氨基酸與其他株間的關系見進化樹（表3）。

表1 核苷酸同源性比較

3 小結與分析

隨著養豬生產向規模化、集約化方向發展，豬偽狂犬病在國內流行日趨廣泛，臨床癥狀各豬場表現不一，有的豬場輕微、病死率高；有的則出現典型的偽狂犬癥狀，哺乳仔豬的病死率高；母豬出現大規模流產。但引起母豬繁殖障礙的原因很多，除遺傳因素外主要有病毒、布魯氏桿菌、弓形蟲、衣原體、鉤端螺旋體引起，且其臨床癥狀均表現流產、木乃伊死胎，不易確診，所以實驗室診斷是目前確診病毒的最可靠方法。

表2 氨基酸同源性比較

表3 進化樹分析

本試驗從某豬場的病料中分離出1株病毒，經PCR擴增試驗證實分離的病毒為偽狂犬病毒，并命名YF株。在規模化豬場仍暴發此類疾病，使養豬生產蒙受了巨大的經濟損失，這表明豬偽狂犬病仍是危害養豬生產的一個重大隱患，特別是在春季和夏季，發病率和死亡率都比較高，所以，早期預防是非常關鍵的。