辣椒疫霉菌對不同辣椒品種抗病性相關酶活性的影響

孫文秀 朱小慧

（長江大學生命科學學院，湖北荊州，434025）

辣椒疫霉菌對不同辣椒品種抗病性相關酶活性的影響

孫文秀 朱小慧

（長江大學生命科學學院，湖北荊州，434025）

對優質抗辣椒疫病品種海豐Zt-277、特大湯椒二號F1和感辣椒疫病品種天驕2號進行辣椒疫霉菌接種，測定了辣椒葉片中與抗病性相關的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性和丙二醛（MDA）的含量變化，結果表明，接種與未接種相比，抗病品種葉片中SOD，POD活性提高幅度要低于感病品種，MDA的含量提高幅度要高于感病品種。但不論辣椒疫霉菌接種與否，抗病品種辣椒葉片中SOD、POD活性高于感病品種；感病品種辣椒葉片中MDA含量高于抗病品種。

辣椒 抗病性 超氧化物歧化酶 過氧化物酶 丙二醛

辣椒疫病（Phytophthora capsiciLeon.）是一種世界性土傳病害，嚴重影響我國及世界各國的辣椒生產，造成巨大的經濟損失。辣椒疫霉菌是一種土傳性寄生菌，存活時間長，寄主范圍廣，致病變異強，菌株間存在明顯的致病分化現象，給有效地防治辣椒疫病帶來很大的困難。

植物在抵御病原微生物的侵染過程中，抗性相關酶發揮著重要作用，這主要包括酚類代謝系統中的一些酶和病原相關蛋白（PR蛋白）家族[1]。如過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（SOD）等是存在于植物體內與抵抗病原微生物侵染有關的酶[2]。為從生理生化方面闡明植物的抗性機理，近年來，人們越來越重視研究植物的抗病性與活性氧及細胞內保護酶系統的關系，先后發現黃瓜、水稻、小麥、玉米、茭白等多種植物受到病原菌感染后，其體內活性氧代謝及防御酶系的活性發生變化，并與植物的抗病性相關[3～7]。但國內外學者就某些植物的抗病性與活性氧及其代謝酶的關系的研究中，試驗結果不盡一致。

近年來，國內外學者對辣椒疫霉菌的分類、形態特征和發病癥狀有較為詳細的研究。本試驗對不同抗性辣椒品種接種疫霉菌后葉片中抗病性相關酶的活性進行測定，并分析其與抗病性的關系，以期為辣椒苗期抗疫病性早期鑒定和防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒品種為經抗病性鑒定的海豐Zt-277（高抗）（編號為1號）、特大湯椒二號F1（抗病）（編號為2號）和天驕2號（感病）（編號為3號）。

供試菌種選用分離自湖北荊州辣椒田的致病力較強的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici），編號為JZ-01。

試驗所用試劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、磷酸緩沖液、甲硫氨酸、EDTA-Na2、核黃素、酶液、愈創木酚、10%三氯乙酸、0.6%硫代巴比妥酸。

1.2 試驗方法

①辣椒疫霉菌接種 將供試辣椒疫霉菌JZ-01首先從試管中轉移至燕麥瓊脂培養基（OMA）平板上，培養7 d后用Petri溶液培養3 d，于4℃冰箱中放置30 min誘發產生大量孢子囊并釋放游動孢子，配制一定濃度的游動孢子懸浮液作為接種體。辣椒種子用1%的次氯酸鈉液表面消毒1 min，自來水反復沖洗后，置28℃溫箱中黑暗保濕催芽，露白后，播入裝有滅菌土（120℃，2 h）的花盆中，生長至5～6葉期用已配好的游動孢子懸浮液進行接種。

②酶活性的測定 辣椒疫霉菌接種后5 d取樣，剪取接種植株倒3葉葉片，去除葉脈后剪碎，取0.5 g置于預冷的研缽中，加1.0 mL預冷的磷酸緩沖液（pH值7.8）和少許聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，于4℃，13 000 r/min下離心20 min，上清液即為酶液粗提液。以未接種植株倒3葉葉片為對照。試驗重復3次，取平均值。

表1 辣椒疫霉菌接種對不同辣椒品種SOD，POD活性和MDA含量的影響

a.超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 參照陳志誼等[8]方法并稍作修改。在3 mL反應體系中，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液 1.5 mL，130 mmol/L甲硫氨酸 0.3 mL，750 μmol/L NBT 0.3 mL，100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL，20 μmol/L核黃素0.3 mL，蒸餾水0.25 mL，酶液0.05 mL。以不加酶液為對照，混勻后于4 000 lx日光下反應20 min（要求各管受光情況一致，溫度高時時間縮短，溫度低時時間延長）。以抑制氮藍四唑（NBT）光化還原的50%為一個酶活性單位，按下式計算SOD的活性：SOD總活性＝(ACK－AE)×V/(ACK×0.5× W×Vt)。

式中，ACK為對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積 （mL）；Vt為測定時樣品用量（mL）；W為葉樣品鮮質量（g）。SOD單位為U/g。

b.過氧化物酶（POD）活性的測定 POD活性測定參照李靖等[9]方法并加以改進。

c.丙二醛（MDA）含量測定 參照趙世杰等[10]方法測定MDA含量。取上清液分別在450 nm，532 nm和600 nm處測定吸光度值OD450、OD532和OD600。按公式：C＝6.45（OD532－OD600）－0.56OD450求出樣品的MDA濃度，MDA含量＝MDA濃度×提取液體積／植物組織鮮質量，MDA單位為μmol/g。

2 結果與分析

2.1 辣椒疫霉菌接種對辣椒葉片SOD活性的影響

不同抗性辣椒品種接種辣椒疫霉菌后SOD活性有明顯差異（表1）。未接種辣椒疫霉菌時，對辣椒疫病抗性越強的辣椒葉片中SOD活性越高，海豐Zt－277葉片中SOD活性達402.38 U/g，而感病辣椒品種葉片中SOD活性為327.15 U/g。辣椒疫霉菌接種5 d后，供試辣椒葉片中SOD的活性均有所提高，但提高的幅度因抗性的強弱而不同：海豐Zt－277提高幅度最小，僅有5.02%；特大湯椒二號F1葉片中SOD活性提高幅度較大；而感病品種天驕2號葉片中SOD活性提高率為21.52%。由此可以看出，SOD含量的高低與辣椒抗病性強弱有一定的關系。

2.2 辣椒疫霉菌接種對辣椒葉片POD活性的影響

由表1可知，不論接種辣椒疫霉菌與否，供試不同抗性的辣椒葉片中POD活性均較低，但接種辣椒疫霉菌5 d后，POD活性增幅較大。接種后高抗和抗病品種葉片中POD活性比接種前分別提高24.97%和23.66%；而感病品種天驕2號葉片中POD活性提高53.83%，上升劇烈。由此可以看出，接種辣椒疫霉菌后不同抗性的辣椒葉片中POD活性均有所升高，且感病品種POD活性提高幅度明顯高于高抗和抗病品種。

2.3 辣椒疫霉菌接種對辣椒葉片丙二醛（MDA）含量的影響

由表1可以看出，在無辣椒疫霉菌脅迫時，辣椒葉片中MDA含量普遍較低，且抗辣椒疫病的辣椒品種葉片中MDA含量比感辣椒疫病品種低，接種辣椒疫霉菌后植株體內的MDA含量均高于未接種植株，且不同品種間MDA含量變化較大。高抗材料海豐Zt－277葉片中MDA含量大幅提高，達60%以上；而感病材料天驕2號葉片中MDA含量提高幅度明顯低于抗病品種，但抗病品種中MDA含量仍低于感病品種。

3 小結與討論

研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過程中，其細胞內自由基產生和清除的平衡會受到破壞，使一系列活性氧積累，傷害植物細胞膜系統，造成色素損失、膜透性擴大、離子外滲，甚至導致植株死亡等。植物體內廣泛存在能清除活性氧代謝的保護酶，其中SOD，POD和CAT是細胞抵御活性氧傷害的主要酶類，可以保護膜系統免受自由基的傷害，這3種酶與植物抗病性有重要關系。MDA是膜脂過氧化的主要產物之一，它的積累是活性氧毒害作用的表現，可作為膜脂過氧化作用的一種指標。

本試驗中，不論接種辣椒疫霉菌與否，抗病品種辣椒葉片中SOD，POD活性高于感病品種，但接種疫霉菌后，抗病品種葉片中SOD，POD活性提高幅度要低于感病品種，這與馬海賓等[11]的研究結果基本一致。本研究表明感病品種辣椒葉片中MDA含量在接種辣椒疫霉菌前后均高于抗病品種，但抗病品種辣椒葉片中MDA含量提高幅度要高于感病品種。這表明海豐Zt－277抗病品種具有清除自由基和抗膜脂過氧化的作用，與該品種接種后辣椒疫病發病輕、抗性好是一致的。

植物中與抗病性相關的酶有多種，它們是相互協同而不是單獨起作用的[12]，不同植物甚至同種植物的不同種、不同脅迫因子等條件下酶活性的變化與抗病性也不相同，甚至相反。如在水稻白葉枯病的研究中，吳岳軒等[13]、曾富華等[14]、廖朝暉等[15]、肖用森等[16]發現水稻感染白葉枯病菌后葉片中 SOD，POD活性和MDA含量變化結果不一致。上述試驗結果一方面可解釋不同植物病害系統，其抗病反應過程有差異，且不可能所有的病害系統都與POD和SOD等有相同的變化關系，即使有關也可能存在程度和方法上的差異。另一方面也說明，確定某種作物抗或感某種病害除對抗性相關酶活性和個別物質含量的變化進行研究外，還需要對其他抗性相關系統作進一步探討。

[1]Schneider S，Ullrich W.Differential induction of resistance and enhanced enzyme activities in cucumber and tobacco caused by treatment with various abiotic and biotic inducers[J].Physiol Mol Plant Pathol，1994，45：291-304.

[2]Ahl-Goy P，Felix G，Metraux J P，et al.Resistance to disease in the hybrid Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi is associated with high constitutive levels of β-1,3-glucanase,chitinase,peroxidase and polyphenoloxidase[J]. Physiol Mol Plant Pathol，1992，41：11-21.

[3]徐建華，利容千，王建波．黃瓜不同抗病品種感染鐮刀菌枯萎病菌后幾種酶活性的變化[J]．植物病理學報，1995，25（3）：239-242.

[4]吳岳軒，曾富華，王榮臣．雜交稻對白葉枯病的誘導抗性與細胞內防御酶系統關系的初步研究[J]．植物病理學報，1996，26（2）：127-131.

[5]王雅平，吳兆蘇，劉伊強．小麥抗赤霉病的生化研究及其機制的探討[J]．作物學報，1994，20（3）：327-333.

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[9]李靖，利容千，袁文靜.黃瓜感染霜霉病菌葉片中一些酶活性的變化[J].植物病理學報，1991，21(4):277-282.

[10]趙世杰，許長成，鄒琦，等．植物組織中丙二醛測定方法的改進[J]．植物生理學通訊，1994，30（3）：207-210．

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[12]張國良，戴其根，張洪程．施硅增強水稻對紋枯病的抗性[J]．植物生理與分子生物學學報，2006，32（5）：600-606．

[13]吳岳軒，曾富華，王榮臣．雜交稻對白葉枯病的誘導抗性與細胞內防御酶系統關系的初步研究[J]．植物病理學報，1996，26（2）：127-131.

[14]曾富華，吳岳軒，羅澤民，等．稻白葉枯病不同毒力株細菌的誘導抗病性與活性氧代謝的關系[J]．湖南農業大學學報，1998，2（6）：450-455.

[15]廖朝暉，朱必鳳，劉安玲．水稻對白葉枯病菌抗性與活性氧關系的研究[J]．中山大學學報：自然科學版，2002，41（4）：78-81.

[16]肖用森，王正直，郭紹川．白葉枯病菌對雜交稻幼苗葉片中活性氧清除劑的影響[J]．作物學報，1998（24）：118-122.

Effects of Phytophthora capsicion Activities of Enzymes Related to Disease-resistance in Pepper

SUN Wenxiu,ZHU Xiaohui
(College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025)

Two resistant cultivars,Haifeng Zt-277(high resistant to Phy to phthorablight),Tangjiao No.2(resistant to Phy to phthorablight),and a susceptible cultivar Tianjiao No.2 (susceptible to Phy to phthorablight)were used as materials for Phytophthora capsiciinoculation.The activities of enzymes related to disease-resistance including superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD)and the content of malondialdehyde (MDA)in pepper leaves were tested after the inoculation. The results indicated that the activities of SOD and POD in resistant pepper leaves were significantly higher than those of susceptible pepper whether or not inoculated withP.capsici.However,the MDA content in the susceptible pepper was higher than that of resistant peppers.

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.024

本研究受長江大學博士創新基金（2006A00433）資助

孫文秀（1979-），女，博士，講師，主要研究方向為植物病理學。電話：13797396503

2009-02-18

Ker words:Pepper;Disease-resistance;Superoxide dismutase;Peroxidase;Malondialdehyde