２，７－二氯熒光素與蛋白質相互作用的分光光度法研究

于文萃　孫麗軍

[摘要]采用分光光度法研究模擬生理條件下2,7－二氯熒光素與牛血清白蛋白的相互作用。結果表明：兩者相互作用形成穩定的復合物，最大吸收波長為509n=，與2,7－二氯熒光素的最大吸收波長502nm比較，紅移了7nm；二者之間主要通過靜電引力結合，但不排除疏水作用力和氫鍵：二者之間的結合數為32。

[關鍵詞]2,7－二氯熒光素牛血清白蛋白分光光度法

中圖分類號：041文獻標識碼：A文章編號：1671－7597(2009)0210005－01

一、引言

光譜法由于方法簡單、容易操作等優點是蛋白質與藥物分子研究的主要方法，熒光素近年來得到廣泛應用，本文采分光光度法對2,7－二氯熒光素與牛血清白蛋白的相互作用進行研究。

二、實驗部分

(一)儀器與試劑

自動電位滴定計，78HW－恒溫加熱磁力攪拌器，UV-240IPC紫外光譜儀。牛血清白蛋白用pH 7.4 Tris-HCl緩沖溶液配制其儲備液(7.7×10^-5mol·L^-1)，4℃保存于暗處；2,7－二氯熒光素，儲備液用蒸餾水配制；1.0mol·L^-1氯化鈉溶液用于維持體系的離子強度；三羥甲基氨基甲烷一鹽酸緩沖溶液(pH 7.4)，用0.2mol·L^-1的三羥甲基氨基甲烷溶液和0.1mol·L^-1鹽酸溶液配制；實驗用水為二次蒸餾水。

(二)實驗方法

于10mL比色管中，依次加入NaCI溶液、2,7－二氯熒光素溶液、BSA溶液，用pH 7.4 Tris－HCl緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置10min。以相應的試劑空白為參比，室溫下用1cm比色皿，在一定波長下測其吸光度。(1)固定BSA溶液濃度，改變2,7－二氯熒光素的濃度，在選定波長范圍內掃描吸收光譜見圖1－1。(2)固定2,7－二氯熒光素溶液的濃度，改變BSA溶液濃度。配制該系列溶液過程中發現：隨著BSA溶液濃度的增太，溶液顏色由2,7－二氯熒光素的淺綠色，逐漸過渡到桃紅色。在選定波長范圍內掃描吸收光譜，見圖2－2。

三、結果與討論

(一)吸收光譜

圖2－1為模擬生理條件下(pH 7.4 Tris－HCl緩沖溶液，離子強度1＝0.1)2,7－二氯熒光素對BSA吸收光譜的影響圖。從圖中看出：BSA在400－750 nm波長內沒有吸收，隨著2,7－二氯熒光素溶液濃度的增大，吸光度值增大，但譜線的形狀基本保持不變，最大吸收波長也無明顯移動。因此，不能說明BSA與2,7－二氯熒光素相互作用生成了復合物。因為吸光度的變化很可能是由于2,7－二氯熒光素濃度的不斷增大而引起吸收程度的改變。為此，實驗過程中又固定2,7－二氯熒光素溶液的濃度、改變BSA溶液的濃度，掃描混合物的吸收光譜圖，結果發現：BSA的濃度為7.7×10^-6mol·L^-1時混合體系最大吸收波長發生了改變。據此，本實驗研究了BSA溶液的濃度為7.7×10^-6mol·L^-1時與DCF的作用。圖2－2為模擬生理條件下2,7一二氯熒光素與BSA作用前后的吸收光譜圖。從圖中看出：2,7－二氯熒光素的最大吸收波長為502nm，與BSA作用后最大吸收波長紅移。由于BSA在該波段沒有吸收，2,7－二氯熒光素的濃度變化只影響吸光度的變化，而不會使最大吸收波長發生移動，導致波長位移的因素只可能是2,7－二氯熒光素與BSA發生相互作用生成了復合物。綜上所述得出結論：2,7－二氯熒光素與BSA在模擬生理條件下作用生成了復合物。由于在BSA的濃度為7.7×10^-6mol·L^-1時與DCF反應后最大吸收波長紅移到509nm，故在摩爾比法中選擇該波長為測定波長。

(二)2,7－二氯熒光素與BSA作用位點、作用力類型及結合數的研究

(1)2,7－二氯熒光素與BSA相互作用的作用位點的研究

本論文研究的2,7－二氯熒光素是一種有機小分子，結合分析我們推測：2,7－二氯熒光素與BSA相互作用主要是與BSA中的精氨酸、賴氨酸殘基結合。

(2)2,7－二氯熒光素與BSA作用力類型的研究

本論文吸收光譜部分已論述了2,7－二氯熒光素與BSA發生相互作用是由于生成了復合物，這表明兩者之間存在著作用力。從分子結構上看，BSA分子中存在著不同基團，如－H、－NH₂、＞C＝0等，2,7－二氯熒光素存在著＞C＝0、陰離子配體等。BSA分子中的－H與2,7－二氯熒光素的＞C＝0之間可能形成氫鍵：在水溶液中，BSA中的－NH^3＋與2,7－二氯熒光素的陰離子配體之間也可能存在靜電引力；還有兩者含有一些極性很差、疏水性較強的基團間也可能靠疏水作用力結合。在實驗過程中還發現：配制系列不同濃度BSA溶液時，由于BSA濃度的增大，溶液顏色由淺綠色變成桃紅色，這種現象的產生說明靜電引力在BSA與2,7－二氯熒光素的結合中起關鍵作用。由此推測2,7－二氯熒光素與牛血清白蛋白主要靠靜電引力結合，但不排除疏水作用力和氫鍵。

(3)結合數的測定

本文采用摩爾比法測定了2,7－二氯熒光素與BSA相互作用的結合個數。固定BSA濃度，改變2,7－二氯熒光素的濃度，在波長509nm處，以試劑空白為參比，測定吸光度值A。以吸光度值A對摩爾比作圖，見圖2－3。從圖中可以看出：曲線中有折點出現。依據摩爾比法原理：折點所對應的比值正對應于每一個BSA分子所結合的2,7－二氯熒光素分子的數目。圖中折點對應的值約為32，即是說每個BSA分子所結合的2,7－二氯熒光素分子的數目為32。

四、結論

模擬生理條件下，2,7－二氯熒光素與BSA作用后最大吸收波長發生紅移，實驗結果說明2,7－二氯熒光素與BSA作用生成了復合物。該論文探討了兩者相互作用的作用力類型和作用位點，并采用摩爾比法成功得到了兩者相互作用的結合數為32。

作者簡介：

于文萃，女，漢族，遼寧省丹東市人，助教，研究方向：化學工程。